Aplicaciones de la técnica de microarrays en ciencias biomédicas:
presente y futuro
Dra. Paola Roxana Barrero
Investigadora
Asistente CONICET
Laboratorio
de Virología, Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez”
Gallo
1330 piso 2 C1425EDF Buenos Aires Argentina
Recibido:
28/10/2005
Aceptado:
2/12/2005
En esta era
donde la globalización ocupa las primeras páginas de los medios de comunicación
masivos, donde la tecnología y las comunicaciones son pilares de la economía
mundial, la ciencia tiene sus propios desafíos. Tanto la globalización como la
tecnificación han producido un cambio esencial en el método científico, la
relación “un experimento, un dato” deja de ser obvia, y el resultado final de
los nuevos experimentos es un caudal de datos que deben procesarse
minuciosamente para extraer la
información útil al científico. Desde que se completó el proyecto genoma
humano, las preguntas se han sucedido en cuanto a identificar las funciones,
regulación e interacción de genes en procesos celulares y cambios en la
expresión génica debidos a enfermedad o tratamiento. Una década atrás pensar en
un experimento que abarcara la detección de cada transcripto en una célula
hubiera parecido extraído de una película de ciencia ficción. Hoy es posible
gracias a que múltiples disciplinas aunaron esfuerzos para integrarse en el
desarrollo, diseño y análisis de microarrays.
Pero ¿qué es un microarray? ¿Qué
preguntas pueden contestar estos experimentos?
Espero que
luego de leer este artículo tenga el lector una idea más clara y una
perspectiva de los alcances de esta nueva tecnología.
Introducción
Los genes consisten en porciones de ácido desoxirribonucleico
(DNA) que codifican por una proteína en particular. Cada segmento de DNA
genómico, organizado en cromosomas en el núcleo celular, está construido con
cuatro bloques de nucleótidos constituido por un grupo fosfato, un azúcar
desoxirribosa y una de las cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), guanina (G),
citosina (C) y timina (T). Durante la síntesis de RNA (transcripción) la doble
cadena de DNA se despliega y una de ellas es usada como molde para generar una copia
complementaria de cadena simple con la base uracilo que reemplaza a la timina.
El RNA es procesado luego de manera que a partir de un transcripto primario se
generan diferentes clases, entre ellas el mRNA que en eucariotas lleva un cap
5’, una cola de poli-A y no contiene intrones. En el proceso siguiente de
traducción, se sintetizan proteínas a partir del mRNA en los ribosomas. La
correspondencia entre las cuatro letras presentes en el DNA y los 20
aminoácidos que forman las proteínas está dada por el código genético, que
vincula tres bases (codón) a un aminoácido. La proteína sufre diferentes
modificaciones post-traducción hasta ser completamente funcional. De esta
manera, las características estructurales y funcionales de células y tejidos
están determinadas por la expresión simultánea, selectiva y diferencial de
miles de genes (Figura 1).
Una propiedad importante del DNA es la complementariedad de
las bases que lo componen, así la timina se complementa con la adenina y la
guanina con la citosina por medio de puentes hidrógeno de las cadenas opuestas
del DNA. Esta propiedad es la base molecular de la técnica de microarrays, donde hebras de DNA de
diferente origen van a hibridizarse por complementariedad de las bases que las
componen.
Figura 1: Dogma central de la biología molecular: el
material genético consiste de DNA, que se transcribe a mRNA que sirve como
molde para la síntesis de proteínas. mRNA: RNA mensajero; rRNA: RNA ribosomal;
tRNA: RNA de transferencia.
El fundamento de
la tecnología empleada en microarrays
La metodología clásica utilizada
para la detección y cuantificación de mRNA presente en una célula es el
análisis por Northern blot donde una
sonda radioactiva en solución se une con un mRNA inmovilizado en un soporte.
Otro método usado es la RT-PCR, donde el mRNA es copiado a cDNA (DNA
complementario) y se genera un intermediario de doble cadena por la reacción de
transcripción reversa (RT) y posterior amplificación de la cadena por la
reacción de la polimerasa (PCR). En estos ensayos el principio fundamental es
la hibridizacion, que se basa en la complementariedad de las bases, pero su
debilidad es la detección. En el primer caso la detección de emisión de
radioactividad requiere pasos adicionales como la autorradiografía y en el
mejor de los casos el escaneo con detectores de radiaciones b y g que aumentan hasta 100 veces la sensibilidad de la técnica.
En el caso de la RT-PCR los niveles de detección han aumentado
significativamente mostrando en tiempo real la duplicación exacta del material
inicial en la reacción de PCR por la incorporación de fluoróforos a la doble
cadena naciente. Esto permite detectar cambios de dos órdenes de magnitud
comparado con los geles de bromuro de etidio que manifiestan cambios de diez órdenes
de magnitud.
Estas técnicas suplieron las
necesidades durante muchos años pero sufren la limitación del número de genes a
reportar. Actualmente se requieren de reportes globales o de miles de genes a
la vez, imposibles de detectar por radioactividad, debido a que estos ensayos
soportan una cierta densidad de puntos en simultáneo, o por PCR en tiempo real,
dadas las limitaciones de realizar los ensayos de 96 muestras cada vez (una
placa).
La palabra microarray deriva del griego mikro
(pequeño) y del inglés array
(distribución ordenada). Podríamos decir que las micromatrices o microarreglos
permiten el depósito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes
sobre un portaobjetos para su estudio en paralelo. De esta manera es posible
tener una visión instantánea de actividad de genomas completos o de un grupo
selecto de genes.
En los estudios de microarrays se combinan las técnicas de
hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia. De esta
manera, sólo en los puntos del portaobjeto donde haya ocurrido hibridización
habrá fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia detectada será
proporcional al nivel de expresión del gen en estudio.
Una condición indispensable es
que cada uno de los genes que esté representado sea fácilmente distinguible de
otros. En otras palabras la porción del gen inmovilizada en el portaobjeto debe
llevar consigo, independientemente de su tamaño, su cédula de identidad. Este
punto es de especial importancia en el diseño de los microarrays y se basa en búsquedas exhaustivas en las bases de
datos públicas (como Unigene y GenBank) y selección por ensayos de
prueba y error.
Componentes de
un experimento de microarrays
Dada una pregunta biológica o un
planteo de sondeo global se obtiene una muestra que será marcada para su
posterior detección. Esta muestra marcada es enfrentada al microarray donde ocurre la hibridización. Un seguimiento exhaustivo
por análisis de imágenes detectará los puntos marcados y los remitirá al
correspondiente gen. Luego, por uso de algoritmos de interpretación se
extraerán los datos más relevantes según la hipótesis o se describirán los
aspectos que marcan diferencias significativas en experimentos de exploración
(Figura 2). Este esquema básico refleja, en cada uno de sus componentes,
decisiones importantes que el investigador debe tomar y que no limitan el
método a una hazaña biotecnológica sino al resultado de un arduo entrenamiento
técnico y del trabajo en equipo. Comentaremos sus componentes a continuación.
Muestras
biológicas
El primer componente que
introduce variación al experimento es la muestra en sí. El éxito de un ensayo
de microarrays depende en gran parte
de la calidad de la muestra obtenida. El RNA total debe estar intacto y puro,
no debe contener proteínas ni DNA contaminante. Para ello se exige que sea
evaluada su cantidad y calidad por espectrofotometría y su integridad por
electroforesis (deben observarse las bandas de rRNA 28S y 18S en proporción y
peso molecular adecuado).
Sin hacer mención de los aspectos
éticos subyacentes, definir patrones universales con experimentos costosos como
los de microarrays es una cuestión
que no tiene solución aún. La heterogeneidad que presentan líneas celulares
inmortalizadas es mínima ante la que pueda presentar una biopsia tomada de un
tejido tumoral. Es imposible tener dos muestras biológicas del mismo individuo
que den resultados similares por el solo hecho de haberlas manipulado en
eventos independientes. A su vez, las comparaciones suelen hacerse contra
tejidos normales, pero no existen consensos para las definiciones de normal y
afectado, dado que factores como los antecedentes genéticos, sexo, edad, etapa
de desarrollo, diferenciación y crecimiento dirigen los patrones de expresión.
Tampoco debemos olvidarnos que los tejidos son de diversa composición celular y
que cada una se estas células activará diferentes programas de expresión ante
diferentes estímulos.
Se ha planteado el uso de mRNA
“universales” o de especies diferentes que funcionen como controles internos
del ensayo. Estos controles se procesan en conjunto con la muestra y contienen
en el microarray sondas específicas que monitorean la calidad
del ensayo. De esta manera, se comprobó por diluciones seriadas que los más
modernos microarrays pueden detectar
hasta un transcripto (1 molécula aislada de mRNA). Este es un paso importante
que da confiabilidad a la técnica, probando que hasta en el nivel más bajo de
transcripción, los transcriptos más raros y menos abundantes serán tomados en
cuenta para el análisis.
Diseño experimental
El diseño experimental es
esencial en los experimentos de microarrays
y es crucial desde la recolección de muestras y criterios de inclusión, la
elección del microarray a ensayar y
el método para inferir los resultados. En general las preguntas biológicas
conducen a probar hipótesis o a producir datos nuevos mediante asociación con
parámetros estadísticos. En el primer caso los resultados obtenidos corroboran
la hipótesis planteada y en el segundo los datos hablan por si mismos. Ambas
estrategias son válidas si las herramientas usadas para convertir los datos en
información y la información en conocimiento son robustas.
En muestras patológicas se ha
propuesto trabajar con mezclas provenientes de diferentes pacientes afectados
para reducir el efecto “personal” en el patrón de expresión. También es
indispensable realizar duplicaciones biológicas
y técnicas del experimento. Un duplicado biológico es aquel donde se
obtiene RNA en dos eventos diferentes o RNA de individuos diferentes que se
integran en el análisis. Los duplicados técnicos son las hibridizaciones de un
mismo RNA en diferentes microarrays
para evaluar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. De todas maneras,
estas repeticiones, aunque mejoran la certeza de los datos obtenidos, no
solucionan el problema del tamaño de la muestra en microarrays.
Tipos de microarrays
El concepto básico en microarrays es el posicionamiento
preciso en un soporte sólido de elementos que funcionen como detectores
moleculares en altas densidades.
En la práctica, los microarrays
abarcan una amplia gama que puede tener diferentes soportes (membranas o
vidrio) y diferentes moléculas que interaccionan en este medio.
Para poder clasificar los microarrays debemos dejar claro qué se
entiende por target (blanco) y que se
define como probe (sonda). Existen
controversias al respecto pero tomaremos por blanco a la molécula libre y como sonda a la inmovilizada.
Existen diversos tipos de microarrays según las sondas utilizadas que abarcan
metodologías muy variadas que van desde lo más casero hasta lo más sofisticado.
Los tipos más comunes son:
Microarrays de ácidos nucleicos
Microarrays de
cDNA
Las sondas son producidas en
laboratorios mediante la amplificación selectiva de cDNAs (100-3000
nucleótidos) por PCR en placas de 96 pocillos. Estos
amplicones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por
capilaridad en portaobjetos de vidrio mediante costosos robots que requieren un
ambiente libre de partículas.
Microarrays de
oligonucleótidos
Las sondas son
porciones de DNA sintético de cadena simple que pueden ser cortas (15-25
nucleótidos) o largas (50-120 nucleótidos). Estos fragmentos pueden ser
presintetizados y depositados en portaobjetos por robots o sintetizados in situ y depositados por ink jet o fotolitografía (DNAchips).
Los microarrays que contienen fragmentos presintetizados (cDNA u
oligos) pueden ser fabricados en laboratorios con infraestructura adecuada, pero
los sintetizados in situ o los que
vienen con genes preseleccionados prearreglados (bioarrays) deben ser adquiridos a diferentes proveedores que poseen
plantas con un nivel más alto de complejidad y delicados controles de calidad.
Los arrays de cDNA son los más
flexibles y usados en investigación porque permiten depositar genes o
fragmentos de genes amplificados de cualquier especie y así diseñar y generar
de manera sencilla y menos costosa el grupo de sondas. Por otro lado, requiere
de réplicas tanto en el mismo soporte como duplicados técnicos, dado que su
punto débil es el depósito del amplicón y la reproducibilidad de sus
características físicas (dimensiones, área, límites). La tendencia actual es
usar oligonucleótidos de longitud corta, aunque todavía existen quienes
cuestionan la especificidad dada por el diseño de sondas tan pequeñas,
evidentemente, años de experiencia en diseño de PCRs avalan las ventajas de
esta opción.
Microarrays de proteínas
Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y
los blancos son muestras de suero o
tejido. Esta técnica se ve por el momento restringida por varios puntos que
requieren de tiempo para esclarecerse. Entre ellos podemos mencionar la
dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3-D como son las proteínas y
detectar interacciones de proteínas plegadas, sin olvidar mencionar que no se
dispone aún de colorantes fluorescentes que permitan cuantificar eficientemente
a estas moléculas.
Microarrays de tejidos (TMA)
Esta técnica trata de resolver
uno de los problemas principales y limitantes en análisis moleculares de
tejidos: el tamaño limitado de la muestra. Se utiliza una aguja hueca par tomar
muestras milimétricas de las regiones de interés de tejidos embebidos en
parafina, en especial biopsias. Luego se depositan de manera ordenada en un
nuevo bloque de parafina y se cortan con un micrótomo entre 100-500 veces y se
reordenan sobre portaobjetos de vidrio donde se realizarán pruebas múltiples a nivel
DNA, RNA y proteínas (inmunohistoquímica, hibridización in situ).
Comparative
Genomic Hybridization (CGH)
Es un método citogenético
molecular que permite monitorear anomalías cromosómicas. Las alteraciones se
clasifican en pérdidas, ganancias y amplificaciones de DNA, incluyendo
mutaciones a nivel de cromosomas completos y por loci. Permite monitorear tumores y defectos congénitos a partir de
cromosomas en metafase o DNA genómico. La técnica se basa en la hibridización
competitiva donde se colorea el DNA tumoral con un marcador fluorescente y el
DNA blanco con otro. Permite el
estudio de material de archivo como muestras congeladas o embebidas en parafina
con el fin de correlacionar la evolución clínica con aberraciones cromosómicas.
La descripción técnica de los
aspectos analíticos de estos últimos tres puntos excede el objetivo de esta
revisión y en adelante nos centraremos en los arreglos más usados que son los
microarreglos de DNA.
Consideraciones
técnicas
Marcación e hibridización del blanco
En los experimentos de expresión
génica el RNA total es obtenido de la muestra biológica y marcado con un
colorante fluorescente para su posterior detección. Las primeras propuestas
fueron marcar con dos colorantes derivados de cianinas (Cy5 rojo y Cy3 verde) las
muestras de RNA total durante el proceso de transcripción reversa o modificar
químicamente los nucleótidos a posteriori.
Estas muestras provenientes de dos condiciones a comparar se mezclan en
cantidades iguales y se hibridizan competitivamente en el mismo microarray. La lectura se hace con
detectores que permitan detectar los espectros de emisión de los dos colorantes
en canales diferentes y generar imágenes separadas para cada uno de ellos. Los
inconvenientes que plantea este procedimiento son las masas abundantes
necesarias de RNA (20-75 mg) y la afinidad diferente de los distintos colorantes por el
blanco. Esto hace imperativo que en el diseño se incluyan experimentos donde
las muestras sean marcadas adicionalmente con el colorante opuesto para obtener
resultados más confiables. Una complejidad adicional se plantea en el análisis
de las imágenes, ya que para medir expresión diferencial deben componerse en un
solo archivo de imágenes la superposición resultante del archivo generado con
el colorante verde y el archivo generado con el colorante rojo (Figura 3). De
esta manera los puntos que resulten verdes estarán expresados diferencialmente
en una condición y los rojos en otra, mientras que los amarillos estarán
expresados en ambas (Figura 3). Estos inconvenientes son superados cuando se
trabaja con protocolos más modernos con RNA copia (cRNA) que resulta de la
transcripción in vitro del RNA
original.
Las cantidades requeridas para
realizar el experimento son ínfimas (0.2-2 mg) y se marca con un solo colorante. La desventaja de este método es que se
hibridiza una muestra por microarray.
En cuanto a la hibridización, las
técnicas y protocolos han mejorado radicalmente con procedimientos que tienden
a reemplazar los hornos de hibridización y posteriores lavados manuales por
condiciones más estandarizadas y cámaras de hibridización flexibles incluidas
sobre el portaobjeto de vidrio (Figura 4)
Análisis de los datos
Una vez obtenido el/los archivos
de imágenes, hay que transformar las intensidades de las señales obtenidas en
datos numéricos, discriminando la señal informativa del ruido que pudiera haber
en segundo plano. En este proceso hay que considerar las dimensiones y forma de
cada punto analizado de la imagen, su localización y los parámetros
estadísticos que pueden asociarse a ellos. Los controles de calidad son
realizados para cada imagen.
Es en este punto donde el trabajo
multidisciplinario se vuelve indispensable. El manejo de una cantidad extensa
de datos en simultáneo requiere el uso de algoritmos de computación para
obtener, manejar, procesar y almacenar la información en paralelo. En este
escenario los bioinformáticos aportan su conocimiento a los experimentos de microarrays.
De esta manera se obtiene una
matriz de expresión donde las filas serán genes y las columnas experimentos. En
los diseños con dos colorantes se trabaja con proporciones entre las
intensidades medidas con cada uno de ellos y en los realizados con un solo
colorante estos datos son absolutos. En ambos casos los datos se normalizan y
transforman para disminuir las variaciones y hacer los cálculos posteriores más
sencillos.
En este punto agregamos al grupo
de trabajo un experto en bioestadística que pueda aplicar los supuestos
correspondientes para realizar comparaciones que sean válidas estadísticamente.
Para un gen dado (fila) pueden compararse las intensidades entre muestras y
generar un reporte que exprese encendido y apagado de genes o de cuántas veces
más o menos expresado se encuentra en las diferentes condiciones ensayadas. No
deben compararse intensidades entre genes (filas) del mismo experimento ya que
el nivel de expresión es una propiedad de cada gen, se puede modificar por la
expresión de otro gen presente en altos niveles en el mismo experimento y está
ligado a complejas vías de control.
Métodos de Agrupamiento y Visualización de los datos
El análisis de agrupamiento o Clustering de la matriz de expresión
consiste en reunir genes basándose en la similitud de su perfil de expresión.
Existen métodos no supervisados y
supervisados basándose en datos previos para concentrar los patrones de
expresión relacionados. Entre los métodos no supervisados el más empleado es
“k-media” y es apto para organizar datos exploratorios exhaustivos. “K-media”
es un algoritmo de partición que divide los ítems en k-grupos de manera que la
suma de las distancias al centro del grupo sea mínima. Por otro lado los
métodos supervisados requieren un grupo de experimentos que los entrene (training set) para generar reglas que
puedan hacer predicciones o clasificar datos a testear (testing set). Entre ellos podemos mencionar a los basados en redes
neuronales de aprendizaje. Los esquemas resultantes son de fácil visualización
y altamente informativos.
Interpretación
de los datos: data mining
Existen
diferentes algoritmos que permiten extraer de un grupo selecto de genes su
ontología (GO). La ontología de los genes
proporciona un vocabulario controlado para describir características de genes y
productos génicos en términos de los procesos
biológicos asociados, los componentes celulares y la función molecular de
manera independiente de la especie en cuestión. Los principios de organización
del GO son que un gen tiene una o más funciones moleculares, usadas en uno o
más procesos biológicos y puede asociarse a uno o más componentes de la célula.
A partir
del conocimiento de los términos de GO y de atribución de éstos a los datos de microarrays se pueden visualizar las
vías metabólicas que están siendo modificadas.
Reporte de los
datos: se creó un consorcio que colecta los
datos mínimos acerca de un experimento de microarrays
(MIAME) de manera que el formato para importar y exportar datos entre
laboratorios sea compatible. Este campo es crítico y las publicaciones
requieren que se cumplan estos puntos.
Las herramientas contenidas el
GEO (Gene Expression Omnibus)
permiten visualizar, buscar y obtener datos sobre expresión génica.
Reflexión final
Cada célula contiene una dotación completa de
cromosomas. Sin embargo, la expresión diferencial de los genes es
la que dará a esa célula su función biológica. Este proceso de expresión génica
es muy complejo en cuanto a regulación y permite a la célula responder de
manera dinámica ante cambios instantáneos. Los experimentos de microarrays permiten monitorear en cada
momento la expresión génica durante una
enfermedad, los cambios en tejidos tumorales, la expresión de marcadores
relacionados con factores pronósticos de enfermedad o toxicidad, y los
polimorfismos de genes, entre otras tantas aplicaciones.
La magnitud creciente de información y el desarrollo de
técnicas innovadoras provee hoy al investigador de herramientas poderosas, flexibles, no tóxicas y de alto rendimiento. Esta escala ampliada, tanto en la cantidad
como en la calidad de los datos obtenidos en experimentos de microarrays plantea una cuestión adicional no sólo porque el volumen de datos que deben ser procesados es muy
elevado, sino también porque muchos de dichos datos son
obtenidos de manera colateral, sin una hipótesis previa que guíe el
experimento, o involucran genes
que hoy no tienen función asignada aún para organismos modelo. La información
global no es ni buena ni mala en sí misma, es un instrumento que, adecuadamente
utilizado, permitirá alcanzar mayores niveles de conocimiento.
La evolución de esta tecnología de avanzada en el tiempo llevó
a una disminución de los costos asociados y de los requerimientos de
infraestructura, haciendo hoy factible su aplicación en empresas farmacéuticas y
en un futuro no muy lejano en centros biomédicos especializados. La
implementación de estudios de expresión génica en la población marcará el
camino hacia una medicina personalizada donde las estrategias de diagnóstico y
monitoreo del tratamiento se basarán en la evidencia aportada por experimentos
de microarrays.
Responsabilidad: los datos y opiniones presentados en esta revisión reflejan
mi punto de vista que ha sido elaborado durante cinco años de lectura de
bibliografía pertinente, discusión con expertos y entrenamiento en los
diferentes aspectos de los ensayos de microarrays.
Referencias y Sitios de interés en Internet
Nature Genetics (1999), Volume 21 No 1s: The chipping forecast I
Nature Genetics (2002), Volume 32 No 4s: The chipping forecast II.
Nature Medicine (2003) Volume 9 No 1: 140-145
Nature Genetics (2005) Volume 37 No 6s: The chipping forecast III
The Gene Expression Omnibus (GEO): A Gene Expression and Hybridization
Repository. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Microarrays: chipping away at the
mysteries of science and medicine.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/microarrays.html#microarrays
The 7 keys
to successful microarray data analysis. http://www.microarraysuccess.com/web/info.html
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Revista QuímicaViva Número 3, año 4, diciembre 2005 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |
