Curso de Introducción al conocimiento científico experimental*

por  Dra. Celia E. Coto

Capítulo 10. Los anticuerpos monoclonales

Brevísima historia.

En 1975 Georges Köhler y el investigador argentino César Milstein fusionaron por primera vez linfocitos con células de un mieloma y obtuvieron un hibridoma: una línea celular inmortal capaz de producir anticuerpos específicos (monoclonales). Por este trabajo, que no patentaron, recibieron el premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1984. La importancia de la producción de anticuerpos monoclonales no se evidenció hasta 1987 cuando estos anticuerpos se produjeron en forma regular en ratones y fueron utilizados en el diagnóstico ya que son anticuerpos de pureza excepcional capaces de reconocer y unirse a un antígeno específico.

             Los anticuerpos monoclonales se utilizan de rutina en muchos procedimientos diagnósticos como por ejemplo:

· mediciones de niveles de proteínas y drogas presentes en el suero

· tipificación de tejidos y de sangre

· identificación de agentes infecciosos

· tipificación de leucemias y linfomas

· identificación de antígenos tumorales

· identificación de células específicas involucradas en la respuesta inmune.

· identificación y cuantificación de hormonas.

¿Cómo surgió la idea de obtener anticuerpos monoclonales?

Qué mejor respuesta que recurrir a las palabras del Dr. Milstein¹:

“ Imaginemos una gran mezcla de sustancias químicas entre las cuales nos interesa sólo una de ellas. Una sustancia entre millones y millones. Es como una aguja en un pajar. Si tenemos un anticuerpo específico contra una sustancia, ese anticuerpo puede funcionar como un imán capaz de ignorar la existencia del pajar y reconocer exclusivamente la aguja. A los ojos de un anticuerpo, el pajar no existe. Este simple concepto dio lugar a lo que se dio en llamar  Inmunoensayos (ver capítulo 9)  que permitieron la medición precisa de hormonas y otras muchas sustancias no sólo en medicina sino en química analítica en general. Los inmunoensayos introdujeron los anticuerpos para su uso como herramienta analítica de importancia fundamental en áreas que nada tenían que ver con la inmunología. El problema era que para preparar un anticuerpo específico era necesario utilizar agujas puras”.

Algo más sobre los anticuerpos

Vimos en el capítulo 9 la estructura básica de los anticuerpos, vamos a repasar y agregar aquí, una serie de conocimientos sobre esas moléculas mágicas. Las inmunoglobulinas o anticuerpos o abreviados (Ab) son una mezcla heterogénea de proteínas que presentan dos tipos de variaciones estructurales. Cambios sutiles en la estructura de los sitios de combinación al antígeno (regiones variables) que determinan la especificidad de unión al antígeno (reconocimiento de un antígeno entre varios parecidos) y diferencias estructurales fuera de la región de unión al antígeno, en las llamadas regiones constantes que se relacionan con otras funciones del anticuerpo denominadas efectoras. Estas actividades efectoras son por ejemplo: activar al complemento o unirse a más de un receptor conocido con el nombre de Fc que están presentes en las membranas de los monocitos y granulocitos (ver capítulo 7). Existen cinco clases de inmunoglobulinas que además de las IgG incluyen a las IgA, IgD, IgE, e IgM. Cada clase de anticuerpos se distinguen entre sí por algunas de sus funciones efectoras y constitución estructural. No vamos a complicar las explicaciones pero para dar una idea concreta diremos que el primer tipo de anticuerpos que aparece en una persona infectada con un virus es del tipo IgM y que recién pasado cierto tiempo aparecen las IgG que son más duraderas. Como las moléculas son estructuralmente diferentes se pueden distinguir fácilmente mediante procedimientos de rutina en el laboratorio clínico.

 Esta situación es vital para el diagnóstico clínico. Volviendo al virus de la rubéola si una mujer embarazada tiene un contacto con un enfermo de rubéola es importante averiguar si ya está protegida o no. Si se le detectan anticuerpos IgM se trata de una infección reciente y hay que preocuparse por el porvenir del bebé ya que el virus de rubéola es teratogénico (puede producir malformaciones en el embrión). Si la mujer tiene anticuerpos IgG la infección fue anterior y no hay de qué preocuparse.

Modo de obtención de los anticuerpos monoclonales.

Problemas que hubo que resolver:

Pasaje de la heterogeneidad a la homogeneidad o del anticuerpo policlonal al anticuerpo monoclonal.

Mientras algo de la heterogeneidad de los anticuerpos deriva de la existencia de clases y subclases de Ig  lo más importante radica en la naturaleza polimórfica de sus regiones variables. Se han hecho estimaciones del número de anticuerpos diferentes que pueden producir las células B del organismo y se llega al fantástico número de más de 10 millones.

En resumen: la respuesta del sistema inmune a cualquier antígeno por más simple que sea éste, es una respuesta policlonal. Lo que quiere decir que el sistema fabrica anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en el antígeno que involucran tanto a la región de unión al antígeno como a las zonas efectoras. Por otro lado, MacFarland Burnet (premio Nobel 1960) postuló la teoría clonal de la generación de anticuerpos es decir la generación de moléculas idénticas en su estructura y en su capacidad de reconocer a un antígeno (¡qué alivio!, gracias a Dolly todos saben qué es un clon).

Cada célula plasmática B (clon B) fabrica un solo tipo de anticuerpo. Este hecho vino en ayuda de Milstein y Köhler que pensaron que si aislaban clones de células B y las cultivaban en placas de plástico de cubetas múltiples, el anticuerpo que producirían las células sería monoclonal. Pero... había un gran inconveniente, las células B mueren a los pocos días de ser cultivadas in-vitro. Entonces, se les ocurrió que si las fusionaban con una célula con potencial de inmortalidad, los híbridos de ambas células podrían fabricar anticuerpos monoclonales casi indefinidamente. Efectivamente fue así, obtuvieron hibridomas la clave para producir anticuerpos monoclonales.

Fusión celular

La fusión celular es un procedimiento que permite que dos células se fusionen entre sí al poner en contacto sus membranas externas citoplasmáticas. En el esquema que sigue se muestra el caso de la fusión celular mediada por un virus, pero también se puede producir la fusión por otros métodos utilizando algunos reactivos químicos. A los efectos de entender el procedimiento vale tanto un virus como una sustancia química. Como vemos hay dos células cuyos diferentes ADN nucleares se pintaron en amarillo y rojo para diferenciarlos. La fusión de las membranas permite la obtención de una célula con dos núcleos. Cuando se produce la mitosis algunas de las células hijas van a heredar los cromosomas de ambos padres, estos son los hibridomas.

Células de mieloma.

Una célula B, como cualquier célula del organismo, puede convertirse en cancerosa, cuando esto ocurre la proliferación de un cultivo de estas células in-vitro se mantiene por períodos prolongados, casi para siempre, a menos que alguna razón accidental lo impida. Köhler y Milstein para salvar el escollo de la vida efímera de las células B en cultivo tuvieron la idea de fusionarlas con células de un mieloma. De este modo combinaron el potencial de crecimiento ilimitado con la especificidad de un anticuerpo producido por células normales B presentes en el bazo de un ratón inmunizado. Esta técnica se conoce con el nombre de hibridización de células somáticas que da lugar a un hibridoma.

El procedimiento se detalla en el dibujo siguiente. Se inmuniza un ratón con un antígeno, al cabo de un tiempo se sacrifica, se extrae el bazo, se separan las células y se cultivan in-vitro en placas de plástico u otro material apropiado (circulitos rojos). Se dispone de un cultivo de células de un mieloma (circulitos azules) y se procede a fusionar ambos cultivos.

 Anticuerpos monoclonales

             Ahora hay que seleccionar los clones que sean hibridomas (1) y esto no es tan simple como hacer puré de papas. Las células de mieloma que eligieron los investigadores perdieron la capacidad para sintetizar la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa. (HGPRT). Por eso son HGPRT^-  (negativas para HGPRT) (ver dibujo) y  a raíz de ello se cultivan en un medio especial llamado HAT ( contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina) porque la enzima de la que carecen las células sintetiza purinas utilizando como fuente precursora a la hipoxantina. La ausencia de la enzima no perjudica el crecimiento de estas células de mieloma ya que en ausencia de la enzima utilizan un camino metabólico alternativo para sintetizar purinas. Sin embargo, la presencia de aminopterina en el medio HAT anula la posibilidad de sobrevida y hay una total dependencia del compuesto  (HGPRT).  

            ¿Qué va a ocurrir después de la fusión y cultivo en medio carente de HGPRT? Las células de mieloma no fusionadas no pueden crecer porque carecen de la enzima HGPRT, las células provenientes del bazo no pueden multiplicar porque tienen una vida corta en cultivo. Sólo van a persistir los hibridomas porque tienen la enzima HGPRT heredada de las células del bazo y las de mieloma aportan la inmortalidad.

            En el paso 2 se prueban los sobrenadantes por la presencia de los anticuerpos deseados. Debido a que los cultivos iniciales de hibridomas se pudieron haber iniciado con más de un clon es necesario clonar nuevamente los cultivos productores de anticuerpos y subcultivarlos (paso 3). En el paso (4) se testean los cultivos por la presencia de anticuerpos y dado que las células productoras constituyen un clon los anticuerpos son monoclonales lo que significa que cada cultivo secreta una sola clase de molécula de anticuerpo dirigida a un solo determinante antígénico de un antígeno preseleccionado. A continuación (paso 5) se realiza un escalamiento (cultivo mayor) de los hibridomas, que cultivados apropiadamente, se mantendrán para siempre ya sea in-vitro con un rendimiento de 10-60 mg/ml o in-vivo en un ratón en el que la concentración de anticuerpo en el suero puede alcanzar valores de 1-10 mg /ml. Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay un movimiento mundial tendiente a no utilizar animales en investigación que combate activamente el uso de ratones.

Tecnología de la producción de anticuerpos monoclonales (AbM) y aplicaciones.

Como vimos el primer paso para producir AbM es inmunizar a un ratón con un antígeno. Cuando el ratón comienza a producir anticuerpos contra el antígeno se le remueve el bazo. Luego se fusionan las células del bazo con células de una línea de mieloma que no sea productora de anticuerpos y que se mantenga en cultivo. La nueva línea celular proveniente de la fusión que sí produce anticuerpos se inyecta en el peritoneo de otro ratón y el fluido ascítico que contiene los anticuerpos se cosecha.

            Entre los factores que afectan la pureza del antígeno se encuentran la edad, el sexo del ratón y la tolerancia inmunológica de cada animal y otros factores que afectan la producción, por eso se estila utilizar adyuvantes para estimular la respuesta inflamatoria.

Test de ELISA y aplicaciones.

Este ensayo biológico descripto en el capítulo 9 fue desarrollado por Engvall y Perlman en 1971. En este ensayo con anticuerpos monoclonales éstos se pegan a la superficie de la placa plástica. La presencia de este anticuerpo se detecta mediante el uso de un anticuerpo policlonal unido a un producto coloreado, si el test es positivo para el monoclonal aparece el color. Los usos comerciales de estos ELISA son de gran demanda así por ejemplo: el test o prueba de embarazo consiste en un anticuerpo monoclonal preparado contra una proteína presente en la orina de mujeres embarazadas. A esto podemos agregar tests para diabetes, para la presencia de antibióticos residuales en la leche y otros.

            Otras aplicaciones, no tan universales como las que se han descripto, es utilizar los anticuerpos monoclonales como proyectiles dirigidos a los receptores de la membrana de las células cancerígenos, asociados a sustancias radiactivas para  matar las células.

Nos queda recorrer un solo tema, la humanización de los anticuerpos monoclonales, como estos anticuerpos se producen en el ratón puede que administrados al hombre con fines terapéuticos, su organismo los rechace, para eso se ha aplicado ingeniería genética y se han unido regiones de los genes que codifican por la proteína de mieloma humano con regiones de un anticuerpo de ratón. Pero la explicación detallada de estas técnicas no las consideraremos aquí. La tecnología del ADN amerita la escritura de nuevos capítulos.

Glosario.

adjuvante: una sustancia que ayuda a aumentar la respuesta antigénica produciendo una inflamación que retiene al antígeno en el sitio de inoculación 

fluido ascítico: líquido de características similares al suero que se acumula por extravasación en la cavidad peritoneal del abdomen.

hipoxantina: derivado natural de una purina raramente se la puede encontrar formando parte de la cadena de ADN.

mieloma: tumor de células B que se origina en la médula ósea.

purina: compuestos orgánicos aromáticos heterocíclicos que forman los ácidos nucleicos. En el ADN existen dos bases purínicas que son la adenina y la guanina.

secretar: segregar.

1. César Milstein. Los anticuerpos monoclonales. La curiosidad como fuente de riqueza. Conferencia dictada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 15 de diciembre de 1999.

http:// www.educ.ar

* Este curso es una contribución de Química Viva educativa  (e-Lab) a la propagación del conocimiento científico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

 
 Volver al menú de selección de capítulo.
 

ISSN 1666-7948 www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

Revista QuímicaViva Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina.  quimicaviva@qb.fcen.uba.ar