Curso de Introducción al conocimiento científico experimental*

por  Dra. Celia E. Coto

 Capítulo 13  

Herramientas moleculares: Biotecnología

Parte 1.                                                        

Introducción.

         Sin dudas se puede considerar al descubrimiento de la  estructura de la molécula del ADN (ácido desoxirribonucleico) como el hallazgo científico más importante del siglo XX. Es como si se hubiera terminado de leer un libro sobre la vida lleno de incógnitas y el ADN fuera la clave para escribir otro en que dichas incógnitas son reveladas.

         El trabajo publicado por Watson y Crick en abril de 1953 permitió establecer que el DNA era la molécula encargada de portar el código genético y por lo tanto la llave de la herencia y la evolución. El conocimiento de cómo se almacenaba y duplicaba la información genética permitió el estudio de la biología a otro nivel iniciándose la era de la Biología molecular además de recibir sus autores el premio Nobel de Fisiología y Medicina. En 1978 el descubrimiento de las enzimas de restricción mereció también el otorgamiento del mismo premio a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith ya que su descubrimiento condujo al desarrollo de la tecnología conocida como del ADN recombinante que culminó con una nueva rama del saber conocida como Biotecnología. Así, la primera aplicación práctica de las enzimas endonucleasas de restricción fue la manipulación de la bacteria E.coli para producir insulina. Las enzimas de restricción son como tijeras que permiten cortar el ADN en sitios específicos, de esta forma se puede remover un segmento de ADN e insertar en su lugar otro y a la vez ese segmento de ADN puede ser incorporado en otro ADN diferente. Mediante esta tecnología fue y es posible el clonado de un gen de interés, determinar las funciones de los genes, producir proteínas en organismos unicelulares o en células cultivadas in-vitro y decenas de aplicaciones más, entre ellas, la obtención de ratones knock out.

         En el esquema siguiente (1) se muestran todas las líneas de desarrollo derivadas de la Biología molecular y las tecnologías asociadas: el cultivo celular y los anticuerpos monoclonales (ver capítulo 10 de este curso). Mediante la tecnología del ADN (ver rama de la izquierda) es posible resolver un crimen determinando el patrón genético de un acusado o de su víctima y asociarlo con alguna huella hallada en la escena del crimen, por ejemplo un pelo o una mancha de sangre o de semen y se puede terminar la identidad de una persona y su relación con sus  padres biológicos.   Ha sido posible crear bancos de secuencias de ADN, ARN y proteínas de diferentes organismos. A la vez que fue posible completar el mapa genético del genoma humano, establecer relaciones filogenéticas con otros animales para completar el árbol evolutivo. Así como se conocen también los mapas genéticos, de virus, bacterias y otros microorganismos.

         La rama del centro muestra las posibilidades de la ingeniería genética, por un lado es posible sintetizar nuevas clases de proteínas  que pueden derivar en nuevos tipos de animales o plantas con los que se producen a su vez nuevos productos alimenticios y también encarar la síntesis de nuevos antibióticos. Mediante ingeniería genética aplicando  el proceso denominado clonado molecular se ha podido producir proteínas en masa, utilizando microorganismos o células en cultivo,. Estas proteínas como las hormonas, entre ellas la insulina, por ejemplo, tienen una aplicación importante en medicina.          

Datos sobresalientes de la estructura del ADN.

         Considerando el carácter básico de este curso vamos a repasar los hechos salientes de la estructura del ADN que permiten su copia fiel dentro de las células y su manipulación fuera de ellas.

Figura 1. Esquema de los alcances del uso de la tecnología del ADN recombinante.¹

¿Cuáles son los componentes básicos de la molécula de ADN? Se trata de un polímero (poli= muchos; mero= partes) o sea es una molécula formada por la repetición de unidades. Cada unidad está constituida por una base ( púrica o pirimidínica), una molécula de azúcar (desoxirribosa) y una de ácido fosfórico. La estructura del ADN se representa como se ve en la figura 2 en un solo plano, nótese que la T y la C tienen un solo anillo y pertenecen a la familia de las pirimidinas. La A y  la G son purinas. Las cadenas se orientan en distintas direcciones 3´ ó  5’, se dice que son antiparalelas. Un hebra tiene la dirección 3’-5’ y la otra 5’-3’ y esto se relaciona, como vamos a ver en la figura 3 con la forma en que se unen a los carbonos del azúcar.

Figura 2. Estructura de una cadena de ADN. Las bases adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G) están enfrentadas de a pares AT/TA; GC/CG el orden va cambiando a lo largo de la molécula pero el enfrentamiento de los pares es obligatorio. En la molécula de ARN la T es reemplazada por el uracilo (U). Cada base está unida a un carbono de la desoxirribosa y las ribosomas forman una larga cadena unidas entre sí por ácido fosfórico.

Una representación plana de la ribosa y desoxirribosa se pueden ver en la figura 3.

Figura 3. Los azúcares constitutivos del ARN y del ADN respectivamente.

La diferencia entre ambas moléculas de azúcar es que la ribosa ha perdido el OH  (oxidrilo u hidroxilo) del C 2’ y ha sido reemplazado por un H (hidrógeno). En el dibujo se destacaron los carbonos 3’ y 5’ que son los carbonos a los que se unen las bases en el ADN o en el ARN. En la molécula de ARN el azúcar que la forma es la ribosa. Si volvemos a mirar la figura 2 entendemos un poco más sobre la estructura de una molécula de ADN. La molécula de ADN está formada por cadenas complementarias que formar una hélice, pero en este dibujo la molécula se muestra sobre el plano con el objeto de visualizar las uniones químicas. El esqueleto externo de d-ribosa-fosfato se lo dibujó en azul y las bases son de otro color. La G es naranja, la C es negra, la A es roja y la T es violeta. Por convención el ADN se escribe según la dirección 5’-3’ la hebra izquierda sería CAGT y la derecha GTCA. En la figura 4 se ilustra la estructura de un ADN tridimensional.

Figura 4. Las bolitas de colores representan los átomos de la molécula, es una representación en 3D. Con rojo se distinguen los átomos de hidrógeno (H); con verde los átomos de oxígeno (O), con verde en círculo más grande son los carbonos (C). Los átomos violeta son los fósforos (P) y los átomos de nitrógeno (N) de las bases se representaron en violeta. En ambas representaciones se muestra claramente que el esqueleto de azúcar fosfato son los “pasamanos” de la escalera de la hélice y la unión entre bases opuestas de ambas cadenas son los “escalones”. La dirección de los pasamanos o cintas se notan perfectamente en el dibujo de la derecha, la hélice va formando un surco menor y un surco mayor. El entrelazamiento de las cadenas se manifiesta claramente así como la direccionalidad a la que nos referimos más arriba. Esta molécula de ADN se comprime tanto que una célula humana puede alojar un metro de ADN comprimido.

La clave de la fidelidad: las uniones hidrógeno

            Antes de continuar con los aspectos específicos del tema, pensemos que la molécula de ADN encierra en su diseño una sabiduría exquisita. ¿Porqué? Porque, si no se guarda fidelidad cada vez que la molécula se copia de la hebra original o molde se producirán alteraciones en los patrones de proteínas que esta molécula codifica. No olvidemos que el ADN de una célula encierra la información para fabricar todas las macromoléculas celulares, proteínas y todos los tipos conocidos de ARN. Si bien a veces, por mutación, se produce algún cambio en su secuencia de nucleótidos, estos cambios pueden llevar entre otros problemas graves a la producción de tumores, por eso la molécula tiene un medio para asegurarse de que si en una cadena hay una A en la otra habrá una T o si en una hay una C en la otra encontraremos una G. ¿Cómo se logra esta fidelidad? Aquí intervienen las uniones hidrógeno.

            Entre las interacciones entre átomos de distintas moléculas encontramos las uniones hidrógeno, se denominan así porque uno de los átomos involucrados es el hidrógeno, estas uniones son más débiles que la uniones iónicas y las covalentes. En este tipo de uniones el hidrógeno se puede unir al oxígeno, al nitrógeno o al flúor que son todos átomos fuertemente electronegativos (llamados donantes) que atraen la nube de electrones que circunda alrededor del núcleo de hidrógeno y de este modo descentralizando la nube deja al átomo de H con carga parcial positiva. aunque el H es un átomo pequeño respecto a los otros la carga que se genera tiene alta densidad y es capaz de atraer un par de electrones de cualquiera de los átomos mencionados estableciendo la unión hidrógeno. En cierto modo entonces la unión H-H se comporta como una unión covalente. ¿Para qué aprender la unión H? se preguntarán. Es que la fidelidad de la copia del ADN depende de ellas, en la figura 5 se explica este punto.

Figura 5. El par T-A comparte dos pares de uniones de hidrógeno y el par C-G comparte tres uniones de H. No hay otros enlaces energéticamente favorables. Salvo el uracilo que al igual que la timina se puede unir a la adenina. Comparar con la figura 2 en la que se señalan los puentes pero donde se han omitido por razones de simplicidad los átomos de H.   

Las cadenas se separan naturalmente y por calentamiento.

         La molécula de ADN es muy estable pero en algún momento las cadenas se tienen que separar. Cuándo y cómo ocurre esto son dos preguntas que surgen espontáneamente. En los procesos naturales que ocurren dentro de la célula sabemos que el ADN tiene que pasar su información al ARN mensajero (ARNm) para que, interactuando con los ribosomas del citoplasma, se sinteticen las proteínas. Sabemos que el ADN nunca sale del núcleo pero sí lo hace el ARN. Durante las diferentes etapas del ciclo celular las células necesitan proteínas y en otros momentos que preceden a la división celular se necesita que las cadenas se abran para poder hacer nuevas copias de ADN. Esto ocurre a temperatura fisiológica (37º C) pero para los objetivos de este capítulo, brindar información sobre herramientas biológicas, nos interesa saber que las dos hebras de ADN se pueden desnaturalizar (separar) por calentamiento a 100º C. Nos estamos refiriendo a la situación en que tenemos ADN puro aislado en tubo de ensayo. A esa temperatura alta se rompe la complementariedad de las bases y la hélice colapsa disociándose en dos hebras de cadena simple. Este proceso puede revertir si la solución se deja enfriar lentamente, entonces la doble cadena se restituye, a este proceso se lo denomina de renaturalización o hibridización. El fenómeno de hibridización ocurre entre cadenas ADN/ADN; ADN/ARN; y ARN/ARN. Cuando el ARN compite por ADN y está en exceso se forman los híbridos entre ambos tipos de ácidos nucleicos (ver figura 6). Es bueno saber que si el enfriamiento de la solución es muy brusco las cadenas quedan definitivamente separadas.

         Las reacciones de hibridización pueden ser usadas para detectar y caracterizar secuencias nucleotídicas utilizando como buscador a  un fragmento de ADN denominado sonda, más adelante explicaremos como se obtiene una sonda.

Enzimas de restricción: tijeras moleculares.

Las enzimas son una clase muy particular de proteínas conocidas como catalizadores que se comportan como una máquina que fabrica envases. Por un lado entra el plástico y, por el otro lado, sale una botella. Al término del proceso la máquina queda invariable pero el sustrato (plástico) se ha convertido en producto (envases). La figura  7 ilustra este punto, una vez que termina la reacción la enzima está lista para iniciar otra. Las enzimas celulares que aseguran la síntesis y la copia (transcripción) del ADN cumplen varias funciones. Las denominadas ADN polimerasas van insertando los nucleótidos trifosfatos de adenina, guanina, citosina o timina de acuerdo con la ley de la complementariedad que le dicta la secuencia de la cadena molde, de modo que luego, a través de los enlaces fosfodiéster que se forman entre las deoxirribosas y los residuos de ácido fosfórico, se van incorporando en forma secuencial para formar la nueva hebra.

Figura 6. Obtención de un híbrido ADN/ARN. Paso aûb el calentamiento separa ambas cadenas de ADN. Paso bûa el proceso revierte por enfriamiento y mantenimiento de la solución a 65ªC, entonces  las cadenas se renaturalizan. Si mientras las cadenas están separadas (b), hay presente un ARN (c) en el paso cûd se formó un híbrido mixto.

         Hay otras enzimas llamadas endonucleasas que cortan la cadena de ADN, están también las ligasas, que reparan esos cortes, y hay otras, las helicasas que permiten que la hélice se abra de a poco y no como vimos que ocurre en el tubo de ensayo al calentar el ADN. Dentro de las células no hay un proceso tan drástico sino que las dos cadenas se abren por un sector que luego se cierra y así sucesivamente. A veces una misma enzima puede cumplir más de un rol. Pero ya hemos dicho que aquí nos interesa aprender el uso de las herramientas moleculares y no lo que ocurre en las células. Si alguien desea conocer este tema puede recurrir a los libros de Biología Molecular, hay muy buenos e ilustrativos.

Volviendo a las enzimas de restricción, tenemos que aclarar que son endonucleasas capaz de hacer cortes en la cadena de ADN doble. La enzima hace dos incisiones cada una sobre el esqueleto del azúcar-fosfato sin dañar las bases. Este tipo de enzimas se aisló a partir de bacterias y se denominan de restricción porque fueron aisladas de cepas de la bacteria Escherichia coli (E.coli) habitante del intestino humano. Se denominan de restricción porque estas cepas tenían la característica de restringir (resistir) la infección con bacteriófagos (virus que atacan a las bacterias). 

Figura 7.  Muestra una enzima con dos sitios de reacción como resultado de la interacción con el sustrato se producen productos nuevos con alta eficiencia.

         Las enzimas de restricción son extremadamente útiles porque a diferencia de las endonucleasas celulares que corten el ADN en cualquier sitio, estas enzimas cortan segmentos de la doble cadena en secuencias nucleotídicas particulares y sólo en dichas secuencias conocidas con el nombre de secuencia de reconocimiento. Esto quiere decir, por ejemplo, que si tengo un ADN de una secuencia como la siguiente:

ATTTCGCTAGGCTA... si la enzima corta la cadena al reconocer una unión GC seguida de TA, en este ejemplo, se producirán dos cortes. Hay ya numerosas enzimas aisladas que cortan en distintos sitios, además según realizan el corte los segmentos de ADN que se forman pueden quedar con los extremos romos o con los extremos pegajosos. Las figuras 8 y 9 muestran ejemplos de lo que estamos explicando.

C C C↓G G G

G G G↓C C C

Figura 8: Corte de restricción con la enzima Sma1 que deja cortes romos.

G↓A A T T    C

C    T T A A↓G

Figura 9. Corte realizado por la enzima Eco R1 que deja terminaciones pegajosas.

Debido a que los sitios de reconocimiento sobre el ADN de las diferentes enzimas de restricción difieren, tanto la longitud como la secuencia exacta donde atacará la enzima varían mucho. Hay muchas enzimas de restricción, nosotros sólo mencionaremos unas pocas. La forma de nombrarlas es la siguiente: tomemos como ejemplo: Eco R1 (viene de la bacteria E.coli cepa R).

         Es posible el apareamiento de las terminaciones de cadena simple con otras secuencias complementarias pertenecientes a otros fragmentos (ver figura 10)  Este trabajo lo hace la ADN ligasa que junta los dos fragmentos o dicho de otro modo genera un “splicing”. Esta palabra no tiene una traducción apropiada en español, el splicing es un fenómeno común dentro de las células. que ocurre, por ejemplo, cuando se pasa la información del ADN al ARN m. En rigor, lo que quiere decir splicing es que se removió un fragmento de ADN y se volvieron a unir las cadenas sin ese fragmento. La utilidad de las enzimas de restricción se muestra porque con su ayuda es posible insertar trozos de ADN en otro ADN o remover genes con el propósito de conocer su función.

Figura 10. La enzima Eco R1 corta en la cadena del fragmento 1 y el mismo tipo de corte en el fragmento 2. Estos cortes los realiza cuando encuentra las secuencias blanco, mostrada en la figura 9. Deja entonces dos extremos complementarios (pegajosos) que luego son ligados por la ADN ligasa, por último se obtiene un ADN recombinante. El análisis de la figura justifica nuestro título de tijeras moleculares.

Clonado molecular

         Es posible aislar una pieza de ADN, eventualmente un gen de interés y clonarlo en un vector que le sirva para facilitar la expresión exclusiva de la proteína codificada por el gen. Esta es una de las aplicaciones más exitosas del ADN recombinante producida por ingeniería genética. Como ejemplos notables tenemos la producción de insulina o de vacunas contra virus como el de la hepatitis B. Veamos el proceso con cierto detalle.

Plásmidos.

         Son moléculas de ADN doble cadena circular que se encuentran dentro de las bacterias. Están separadas físicamente del cromosoma de la bacteria (ver figura 11) y se duplican en forma independiente. Los plásmidos se encuentran también en otros microorganismos como las levaduras. En una bacteria puede haber más de un plásmido, una de las funciones que cumplen en conferir a las bacterias resistencia a los antibióticos.

Figura 11. Esquema de una bacteria en forma de maní con un flagelo. Por razones de simplificar no se aclararon los nombre de los distintos componentes. Volviendo al maní es como si se hubiera quitado parte de la cubierta, vemos pintado en amarillo un plásmido mientras que el cromosma aparece en lila y es mucho mayor que el plásmido. Los puntos representan el citoplasma bacteriano, se observan también los cortes de las capas que recubren al microorganismo.

            Los plásmidos pueden aislarse a partir de las bacterias y tenerlos en un tubo de ensayo, el análisis de las partes funcionales de un plásmido han sido estudiadas y se muestran en un esquema modelo que se presenta en la figura 12.

Figura 12. Dibujo esquemático de un plásmido que muestra resistencia a un antibiótico, en este caso es resistente a la ampicilina. El plásmido está dividido en distintas regiones, generalmente se lee como las agujas del reloj. ORI es el lugar de origen de la replicación, si no existe esta parte del ADN no se replica el plásmido. Hay otro gen (en celeste) que es el que le da resistencia al antibiótioco esto quiere decir que una bacteria que lo porte podrá crecer normalmente en un medio conteniendo ampicilina. Por último hay un sector señalado con verde que puede ser separado del plásmido y reemplazado por otro ADN, en este lugar se puede colocar el gen de interés utilizando la técnica del ADN recombinante.

            A continuación en la figura 13 veremos la técnica de inserción de genes, para su entendimiento recomendamos repasar las nociones presentadas anteriormente sobre las enzimas de restricción.

Figura 13. Procedimiento de inserción de un gen en un plásmido y amplificación del ADN clonado. Tanto el plásmido como la secuencia blanco del ADN a clonar se cortan con la misma enzima, en este caso Eco R1 que produce extremos pegajosos. Al mezclar en un tubo  de ensayo el ADN plasmídico y la secuencia de ADN foráneo se hibridizan y luego de la acción de una ligasa agregada al medio forman un plásmido híbrido que contiene el gen de interés. Luego se procede a transferir el ADN recombinante a una bacteria, este proceso es fácil de realizar. Se procede luego a transferir las bacterias a un medio de cultivo donde se multiplican. A partir de este crecimiento se siembran en un medio sólido (ver figura 14) conteniendo el antibiótico al que es resistente la bacteria que porta el plásmido, es decir que sólo van a crecer las bacterias que contienen el ADN recombinante. Luego a partir de las colonias se hace un cultivo en medio líquido para amplificar y de ese cultivo se purifica el ADN con el inserto.

Figura 14. Placa de petri con una capa de agar nutritivo donde crecen las colonias de bacterias, cada colonia (botón blanco) equivale a un clon, lo que significa que fue originado por la división de una sola bacteria.

Conclusiones

            Hemos visto en esta primera parte sobre Herramientas moleculares los fundamentos básicos que permiten una comprensión elemental de este tema de tanta actualidad y que ha permitido cambios notables en la manufactura de muchos productos de naturaleza farmacológica. En la segunda y tercera parte continuaremos explicando principios básicos y veremos ejemplos concretos del uso de la tecnología molecular. El contenido de este capítulo ha sido escrito en base a mis conocimientos y a la consulta de la Wikipedia. la enciclopedia de Internet. Las figuras fueron obtenidas de diferentes páginas ofrecidas en Internet y modificadas por mí traduciéndolas al español. De no contar con la ayuda de tantas personas anónimas pero habilidosas este capítulo no resultaría didáctico.

* Este curso es una contribución de Química Viva educativa  (e-Lab) a la propagación del conocimiento científico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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ISSN 1666-7948 www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

Revista QuímicaViva Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina.  quimicaviva@qb.fcen.uba.ar