Curso de Introducción al conocimiento científico experimental*

por  Dra. Celia E. Coto

Capítulo 7. Números y ratones

Introducción

En la mayoría de los casos, los resultados de un experimento se pueden cuantificar, es decir, expresar en números, lo que nos permite comparar con otros resultados de experimentos parecidos y sacar conclusiones válidas estadísticamente. Hoy en día es muy fácil realizar estos cálculos matemáticos porque hay numerosos programas de estadística accesibles para computadora que los programas de computación. Lo mismo ocurre cuando se necesita representar en forma de gráficos los resultados de un experimento.

Pero lo principal es saber qué le vamos a pedir a la computadora, que entendamos el significado de los valores que estamos buscando y qué cálculos debemos aplicar a nuestro experimento en particular.

Para ilustrar este concepto vamos a trabajar con ratones no tan simpáticos como los que vemos aquí, pero ratones al fin.

La experimentación con animales podría suponerse como una práctica cruel, sin embargo el uso de animales de laboratorio en investigación científica está estrictamente regulado por los comités de ética de las instituciones donde se desarrolla el trabajo, avalados por otros comités internacionales y en el marco de la convención de Helsinki (declaración internacional de 1974 que reglamenta la experimentación con animales entre otras normas) y otros tratados internacionales. El trabajo con animales de laboratorio (principalmente ratones, ratas, conejos, cobayos y hamsters) es irreemplazable en algunas situaciones sobre todo porque para muchas pruebas, como por ejemplo, las de toxicidad de un determinado medicamento que se va a emplear en seres humanos es necesario conocer de antemano sus efectos tóxicos o indeseables. Existe la voluntad de utilizar otros reactivos en lugar de seres vivos y, en muchos casos se hace, pero la reglamentación del estudio de medicamentos en seres humanos establece que debe haber un estudio previo en animales y a esta instancia se la llama investigación preclínica. Los parámetros que vamos a presentar en este capítulo se obtienen principalmente trabajando con ratones aunque también se pueden usar ratas u otros animales superiores.

Uso del Porcentaje.

En ciertos experimentos puede resultar útil el uso de una relación porcentual o un porcentaje (%). Cuando se calcula el % sobre un conjunto de valores es como si se relativizaran dichos valores respecto del 100%.  Todo de “algo” es el 100% y una parte del todo será 10%, 20%, 50%, 90% etc. El cálculo del % es muy simple y consiste en aplicar una regla de tres. Así por ejemplo, si dispongo de 80 ratones y quiero saber qué % representan 20 ratones, realizo la siguiente cuenta:

nº total de ratones x 100 %   =  80 x 100 %  = 25 %

  nº fracción de ratones                  20

Pasemos a los ejemplos:

Caso 1) Si inyectamos a 80 ratones 20mg de un veneno de serpiente A y mueren todos los ratones, ese veneno produce una letalidad del 100%.

Caso 2 ) Si inyectamos a 80 ratones 20mg de un veneno de serpiente B y mueren 20 ratones (de acuerdo al cálculo) la letalidad es del 25%.

La conclusión del experimento es que el veneno A es más poderoso que el veneno B, ya que a igualdad de cantidad de veneno inyectado la letalidad es mayor.

Sin embargo, si nos ponemos a pensar en el significado de la muerte del 100% de los ratones, nos daríamos cuenta de que al correlacionar con la cantidad de veneno que produce ese efecto (dosis) nos podemos equivocar. Así por ejemplo, si en lugar de 80 ratones usáramos 120, puede que esa misma dosis los mate y entonces el cálculo relativo tomando como base 120 nos daría valores distintos. Esto se vería claramente si construyéramos una curva patrón (ver capítulo 3) con distintas concentraciones de veneno y calculáramos el % de mortalidad. Encontraríamos, entonces, que por encima de cierto valor de concentración de veneno siempre muere el 100% de los animales. Es por eso que se utiliza como parámetro comparativo entre drogas no la mortalidad 100% sino la mortalidad 50% (que involucra a la mitad de la población).

Mortalidad

La dosis letal cincuenta o DL₅₀

Es la cantidad de una sustancia expresada en gr o mgr capaz de matar al 50 % de los animales inoculados. La DL50 es una medida de uso común en Toxicología y en Farmacología, también se aplica para el cálculo de título de un virus que en ese caso sería la cantidad de virus necesaria para matar al 50% de la población. En algunos casos suele usarse la DL25 o la DL75.

No siempre al valor del 50% le corresponde una cantidad entera por ejemplo, si usamos la serie 0, 10, 20, 30 40, 50, 60 y 70 mgr/ml para inyectar grupos de 10 animales, cada uno como se ve en el Cuadro 7.1.

Cuadro 7.1 Resultados obtenidos inoculando distintas concentraciones de un tóxico utilizando 10 animales para cada concentración

Cantidad de sustancia mg	Número de animales muertos	% mortalidad
0	0/10	0
10	1/10	10
20	4/10	40
30	6/10	60
40	8/10	80
50	9/10	90
60	10/10	100
70	10/10	100

Como podemos observar el 50% de letalidad está entre 20 y 30 mg los valores que corresponden a una letalidad inmediatamente por debajo del 50% e inmediatamente por encima del 50%. Existen métodos matemáticos muy viejos como el de Reed y Muench (1936) que permiten determinar con precisión la DL50 realizando cálculos relativamente simples. Otra forma es interpolar en una recta construida con los valores obtenidos, usando los valores de concentración en la abscisa y los de mortalidad en la ordenada. Para el caso  presentado en el Cuadro 6.1, el cálculo es muy simple y se encuentra que la DL50 es de 25 mg.

Morbilidad

      Proporción de personas que enferman en un sitio y tiempo determinado es la definición de morbilidad. También podemos estudiar la morbilidad que produce un virus en ratones o la administración de una droga. Es decir, en lugar de observar una respuesta tan drástica como la muerte, se observa si los animales enferman. Como los animales no pueden expresarse, hay formas de establecer si el animal enferma, que suelen ser  indicativas y certeras. Por ejemplo: se pueden pesar diariamente y construir una curva de peso en gramos que se comparará con el peso de un grupo de animales al que se les administró placebo (aunque en los animales no hay efecto subjetivo de la administración del diluyente sin droga, suele llamarse así igual que si se tratara de personas).  Recordemos lo aprendido en el capítulo 1 “El blanco o el control”. Otra forma de reconocer enfermedad es por la aparición de signos neurológicos: erizamiento del pelo, responder al “spin test” con marcha lateralizada y aparición de parálisis de las patas posteriores. (El spin test consiste en tomar a los ratones por la cola y hacerlos girar varias vueltas, esta acción desencadena una marcha lateralizada de la que se recuperan rápidamente si están sanos). Otras veces los signos neurológicos aparecen simplemente ante un sonido fuerte.

            La morbilidad se puede cuantificar en %, pero permite, además, la medición de otros parámetros (dato o factor que se toma como necesario para valorizar una situación), por ejemplo: día de iniciación de la enfermedad, tiempo que dura la enfermedad, severidad de los síntomas (si es que hay varios). Cuando no se trata de toxicidad aguda, los animales mueren en uno o dos días; la enfermedad precede a la muerte y esta puede ocurrir en un período prolongado que puede alcanzar los 30 días. Los experimentos de producción de tumores por agentes cancerígenos o virus suelen prolongarse durante meses. Cuando se estudian medicamentos para curar enfermedades, no sólo conviene determinar que se alteró  la DL50, a veces es suficiente con observar que los parámetros con los que se caracteriza la enfermedad han disminuido. Los animales no pierden peso, la aparición de los síntomas es más tardía, la severidad de los síntomas es menor, etc.

            No pretendemos en este capítulo agotar el tema del uso de los animales, existen otras numerosas determinaciones que pueden realizarse con ellos. Sí, queremos ofrecer a nuestros lectores algunas reflexiones sobre el manejo de los animales de experimentación (Cuadro 7.2).

  Cuadro 7.2. Consejos sobre el uso de animales en experimentación

· Siempre que sea posible, sustituir el uso de animales por otro tipo de reactivos biológicos.

· Cuando no sea posible prescindir de los animales, realizar los cálculos necesarios para usar el número más pequeño posible. Lo único que hay que tener en cuenta es que los resultados que se obtengan sean significativos (que no ofrezcan dudas).

· No usar animales para responder preguntas sin importancia.

· Mantener los animales en condiciones confortables de higiene y bien alimentados.

· Tratarlos sin crueldad, pero considerarlos que son parte de un experimento. No encariñarse con ellos ni ponerles nombres. Cuando llegue el momento de matarlos, si el experimento lo requiere, al animal que tiene un nombre no se lo podrá matar y puede que se arruine todo el experimento y que el resto de los animales se hayan sacrificado porque sí.

· Los monos son muy sensibles a las manipulaciones, suelen encariñarse con los cuidadores y odiar a los investigadores que los mortifican.

· Trabajar con cualquier animal sin producirle dolor, utilizar anestésicos cuando se los someta a prácticas dolorosas.

· Cuando se trata de ratones hembras con sus crías, no hay que manosear mucho las crías porque, cuando la madre reconoce en ellas el olor de una persona, se las comerá.

· Utilizar técnicas y elementos de protección para resguardar la salud del operador.

· Descartar los animales muertos siguiendo las normas correctas de bioseguridad.

· Hay que familiarizarse con las reglas recomendadas para el uso y manejo de animales. En muchas instituciones se necesita autorización del comité de ética para trabajar con seres vivos.

* Este curso es una contribución de Química Viva educativa  (e-Lab) a la propagación del conocimiento científico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

 
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ISSN 1666-7948 www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

Revista QuímicaViva Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina.  quimicaviva@qb.fcen.uba.ar