Curso de Introducción al conocimiento científico experimental*

por  Dra. Celia E. Coto

 

Capítulo 9. Reactivos  Biológicos: los anticuerpos

 

 

                                                                               

                                                                                     Joan Miró

Brevísima presentación

 

            Los anticuerpos no sólo son componentes  fundamentales del sistema inmune de los vertebrados sino que sirven como reactivos biológicos que se usan de rutina en muchas ensayos que se aplican tanto en el laboratorio clínico como en investigación. Los anticuerpos  dirigidos contra un solo determinante antigénico denominados anticuerpos monoclonales son la base de la industria tecnológica moderna.

           

Un poco de historia

Edward Jenner (1749-1823), médico rural inglés, fue el primero en reconocer la posibilidad de proteger a las personas de una infección mediante la aplicación de un antígeno. Y, sin saberlo, incitar a la respuesta inmune humoral: los anticuerpos. En este caso el antígeno era un virus pariente del virus de viruela llamado viruela de las vacas que infectaba no sólo a las vacas sino que producía lesiones leves en los humanos. A este procedimiento lo denominó vacunación (ya que el material que usaba provenía de las vacas) en ¡1796! y resultó ser la forma más eficaz de proteger contra la viruela (La viruela: peste del pasado amenaza del presente) y el modelo inspirador de Luis Pasteur (1822-1895), el genio más grande de la Microbiología,  para desarrollar vacunas contra el cólera de los pollos, el ántrax y el virus de la rabia. Tengamos en cuenta que para esa época no se sabía lo que era un virus ya que  los virus se identificaron como tales en los comienzos del siglo XX.

Estos avances científicos no tenían una base teórica eran producto del empirismo (Capítulo 4) estaban basados en la observación y en algunas pruebas experimentales crudas e insuficientes para los criterios actuales.

Comenzado el siglo XX se inicia el verdadero desarrollo de la Ciencia inmunológica, está asociada a una larga lista de científicos premiados con el Nobel. 

 

La estructura de los anticuerpos

 

 Los anticuerpos o inmunoglobulinas (se abrevian Ig) son proteínas plasmáticas  de alto peso molecular (150.000 a 900.000 kDa)  (capítulo 5) que generalmente poseen cadenas de hidrato de carbono unidas a los aminoácidos y que se producen en respuesta a la presencia de un antígeno extraño al organismo. Arne Tiselius (1902-1971) aplicó la técnica de la electroforesis  a las proteínas del suero y encontró que los anticuerpos migraban junto a las g- globulinas de ahí que en la actualidad anticuerpos  e inmunglobulinas sean sinónimos.

Se conoce la estructura física de los anticuerpos gracias a los trabajos de Edelman y Porter.  El dibujo de  la figura 9.1 muestra la estructura de las inmunoglobulinas o anticuerpos  en forma de una Y griega. Con los distintos colores se intenta aclarar las características de estas moléculas.

 

            Figura 9.1.  Estructura básica de los anticuerpos. En el diagrama de la izquierda se muestran en rojo las cadenas pesadas y en verde las livianas. El punteado en negro indica el enlace disulfuro. El dibujo de la derecha muestra en azul la región constante y en rojo la región variable.

 

            En el dibujo de la izquierda se colorearon en rojo las cadenas denominadas pesadas (de mayor peso molecular), se trata de dos cadenas unidas entre sí por un puente disulfuro (ver aclaración más abajo) ellas constituyen el tronco o tallo de la Y, además, aparecen dibujadas como formadas por dos bloques. Éstos se conocen como dominios y son partes de la molécula que cumplen ciertas funciones. Las cadenas pesadas se bifurcan al llegar al puente disulfuro y forman los brazos externos de la Y. Las dos cadenas verdes denominadas livianas por su menor peso molecular están unidas cada una a la respectiva cadena pesada también por un puente disulfuro.  El dibujo de la derecha reproduce la misma estructura del anticuerpo pero aquí con los dos colores se está indicando que todo lo marcado en azul es constante, esto quiere decir que todos los anticuerpos tienen esta región de aminoácidos que no cambia y en rojo se muestra la región variable, cuya composición en aminoácidos cambia de anticuerpo a anticuerpo.

 Este concepto se aclara mejor en el análisis de la figura 9.2.  La unidad básica de cada anticuerpo es un monómero. También hay anticuerpos diméricos, triméricos, tetraméricos etc. En resumen: la forma del monómero es una molécula con forma de Y que está constituida por dos cadenas pesadas idénticas (en rojo en el dibujo) y dos cadenas livianas idénticas (en verde) que están conectadas entre sí por puentes disulfuro. Estos puentes son uniones químicas entre dos átomos de azufre ( -S-S-).

 

 ¿Qué les parece si simplificamos el dibujo de las inmunglobulinas (Ig)?. Veamos la figura 9.2  es bastante esquemática y fácil de entender, esta vez tenemos la Y acostada con las dos ramas apuntando hacia la izquierda. Las dos cadenas pesadas idénticas  que aparecen como mirándose en un espejo están unidas por un puente disulfuro (dos átomos de azufre que por un lado se unen entre sí a través de una ligadura y con la otra ligadura (recuerden que el azufre tiene valencia dos) se toman de otro atómo de  la respectiva  cadena. Pueden ver también una vertical punteada que marca una parte de la molécula conocida como Fc (fragmento cristalizable). A su vez la parte de la cadena liviana (extremo de la Y, se denomina fragmento Fab y es la región variable de la molécula que se adapta al antígeno que la provocó. El nombre del fragmento Fab proviene del inglés y se refiere a la región de unión al antígeno (fragment binding antigen).

 

.

Figura 9.2

 

Si a un anticuerpo lo sometemos a la acción de una enzima  llamada papaína o  a otra llamada pepsina, la molécula de anticuerpo se divide en los fragmentos Fc y Fab.

 Resumiendo, la molécula de anticuerpo tiene dominios o regiones que están marcadas en el dibujo como CH (1,2 y 3) eso quiere decir que hay seis regiones invariables o constantes sobre las cadenas pesadas y una sobre cada cadena liviana (CL).  Además hay regiones variables denominadas VH (corresponde a la cadena pesada) y VL a las livianas.

Notemos varias peculiaridades de esta molécula: a) el anticuerpo se unirá al antígeno por las dos puntas de la Y en consecuencia la unión es bivalente b) todos los anticuerpos tienen una estructura básica constante c) los cambios que caracterizan la especificidad del anticuerpo se deben a los fragmentos Fab.

 No es nuestro objetivo internarnos en la genética de los anticuerpos pero a esta altura podemos reflexionar  que esta estructura  peculiar de los anticuerpos con un tronco común y fragmentos Fab diferentes explica en gran parte la existencia de miles y miles de anticuerpos distintos que responden al reto de defendernos contra miles y miles de antígenos.

 Los antígenos son estructuras complejas que presentan muchos determinantes antigénicos (regiones que son reconocidas por los anticuerpos). Esta propiedad  convierte a los antígenos en multivalentes es decir que varias partes de su molécula pueden ser reconocidas por un anticuerpo en particular. 

 

¿Cómo se obtienen los anticuerpos?

Hasta ahora nos referimos a los anticuerpos humanos, los que se forman como consecuencia de una infección natural o por vacunación. Pero para la mayoría de las reacciones en las que se utilizan los anticuerpos en el laboratorio se utilizan inmunosueros preparados en animales: ratones, conejos, cabras y otros.

            Vamos a imaginar que queremos preparar anticuerpos contra glóbulos rojos (GR) humanos,  tendremos que disponer de una solución pura de glóbulos rojos o eritrocitos extraídos de un hombre e inyectarlos en un ratón. Después de varias semanas el animal habrá fabricado anticuerpos contra los GR humanos, para obtener los anticuerpos sangraremos al ratón a blanco (esto quiere decir que obtendremos la mayor cantidad de sangre posible bajo anestesia general y con la premisa de no supervivencia del animal luego de esta operación, es decir que el ratón se duerme y ya no se despierta) y luego separaremos en una centrífuga los glóbulos rojos que sedimentarán dejando en el tubo usado un suero límpido que recogeremos con una pipeta. Es de esperar que este suero contenga las Ig contra los GR humanos y que al poner en contacto en un tubo de ensayo o en una placa el suero con los GR se producirá una reacción antígeno- anticuerpo (similar a la que ocurriría dentro del organismo), reacción que es posible visualizarla de modo directo.  Procedimientos similares para obtener sueros inmunes se pueden realizar utilizando otro tipo de antígenos. Cuanto más puro es el antígeno más específicos serán los anticuerpos porque en una mezcla con impurezas se van a forman anticuerpos contra todas las sustancias antigénicas presentes. Hay algo muy importante que mencionar: los anticuerpos, al ser proteínas, también se pueden emplear como antígenos en una reacción, es decir que se pueden generar anticuerpos contra ellos. Así, si un conejo se inocula con Ig de ratón formará anticuerpos contra la Ig de ratón. Este hecho es fundamental para la aplicación de los inmunoensayos.

 

Ensayos inmunes: resultado de la interacción antígeno-anticuerpo

 

El término afinidad se utiliza para describir la fuerza de la unión entre el sitio de unión del anticuerpo y el sitio de su unión al antígeno que ya sabemos que se conoce con el nombre de epitope, determinante antigénico o hapteno. Hay un valor matemático referido a esta unión denominado constante de asociación que es el valor que mide la fuerza de unión. Como mencionamos antes, los antígenos son multivalentes y los anticuerpos también, esta multivalencia tiende a aumentar la afinidad funcional o avidez. 

Reacción de aglutinación

Si mezclamos glóbulos rojos (1) o esferitas de látex recubiertas de antígenos de estos glóbulos rojos (1) con anticuerpos anti-glóbulos rojos (2) se produce la reacción Ag-Ac (3) y los GR o las esferitas quedan recubiertas y ligadas a los anticuerpos (Ig). Si se emplean GR, por ejemplo, se obtiene una reacción invisible al ojo que puede hacerse visible por el agregado de otros anticuerpos dirigidos contra la Ig (4) (figura 9.3) Como resultado se formará (5) una red de interconexión produciendo un conglomerado visible al ojo. Cuando se trata de GR en el tubo de vidrio aparecerá en el fondo una línea o un pseudo-tejido rojo si se usaron los GR perfectamente visible y diferenciable formado por un sedimento de GR.  

 

Figura 9.3.

 

Los anticuerpos anti-GR se conocen con el nombre de hemolisinas porque si en el tubo de ensayo se agrega complemento (ver capítulo 8) se produce la hemólisis de los GR.  Esta reacción tan simple y tan bella de observar ha sido y es todavía la base de la reacción conocida como fijación del complemento que tiene aplicación en la clínica y en estudios de laboratorio, aunque en investigación la reacción de complemento ha caído en desuso debido a la aparición de técnicas más sofisticadas y sensibles.

La reacción de aglutinación con GR también puede servir como reacción indicadora de la presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado por medio de la visualización de una  reacción positiva o negativa entre un antígeno-anticuerpo.

            Vamos a suponer que queremos saber si una mujer tuvo una infección con virus de rubéola, obtenemos suero de la mujer, separamos las células de la sangre (GR, leucocitos y plaquetas) e investigaremos las presencia de anticuerpos contra el virus de rubéola en el suero de esta mujer. Para ello pondremos en contacto el suero con antígeno de rubéola que podrá ser el virus entero o purificado. ¿Qué puede ocurrir?. Si en el suero hay anticuerpos específicos se van a unir con el antígeno dando una reacción positiva y si no hay anticuerpos la reacción será negativa. En el primer caso al agregar complemento, éste se va unir al complejo virus rubéola-anticuerpos antirrubéola y como tal al ser capturado no estará disponible para interactuar con otro complejo antígeno-anticuerpo. Por eso si a la mezcla anterior (que ha consumido el complemento) le agregamos una preparación GR y anti-GR (puede ser tomado como otro reactivo biológico en esta técnica)  se va a producir la reacción como se ve en 3 de la figura 9.3.

Atentos al aparente rompecabezas: si al cabo de incubar a 37º por un rato  se ve un botón rojo en el fondo de la placa de reacción, los GR de ese reactivo biológico (GR-anti-GR) están intactos aún cuando tengan unidos sus anticuerpos específicos y la reacción será positiva para el virus de rubéola porque el complejo antígeno de rubéola- anticuerpo antirrubeéola tiene capturado al complemento. Si en cambio, los GR se hemolisaron es porque había complemento libre (no hubo reacción) y se consumió para la unión GR-antiGR y en consecuencia No hubo infección con rubéola.

Resumiendo:   Antic.antirrubéola + antígeno rubéola = + ( si no hay hemólisis)

                           Antic.antirrubéola + antígeno rubéola = -  (si hay hemólisis)

 

ELISA – (Enzyme linked immunosorbant assay) o ensayo inmunoabsorbente de unión a una enzima, es un ensayo de gran aplicación tanto en el laboratorio clínico como en investigación. Sepamos, por ejemplo, que es el ensayo más usado para determinar la presencia de proteínas del virus HIV en el suero de posibles infectados. Existen dos tipos de ELISA los llamados directos como se muestra en la figura 9.4 y los indirectos figura 9.6. La base fundamental de la reacción de ELISA es la unión del antígeno a un anticuerpo específico, el revelado de la reacción entre el anticuerpo y el antígeno tiene lugar porque los anticuerpos se han conjugado (unido) a una enzima que al reaccionar con su sustrato da una reacción coloreada.  En la figura 9.5 se muestra una placa de ELISA revelada con un sustrato que vira al color azul. No nos importa qué componentes hay en la placa, sólo sirve para que aprecien lo que son las placas de ELISA y que observen que en los pocillos coloreados hay una reacción positiva de unión entre un anticuerpo y un antígeno.

Figura 9.4. Esquema de una reacción de ELISA.

 

 

 

 

1.     antígeno que se pega al fondo de una placa de plástico

2.     proteína bloqueante que cubre el plástico libre sin recubrir por el antígeno

3.     anticuerpo marcado con una enzima ( puntos verdes)

4.     sustrato

 

 

En primer lugar se dejan adsorber las partículas del antígeno (representadas con bolitas rojas) al fondo de la placa de plástico, generalmente se usan placas con pequeños pozos o pocillos. Para evitar pegadas inespecíficas se agrega una proteína (en azul) que va a cubrir el resto de la placa. Una vez que se ha pegado el antígeno se agrega el anticuerpo, este anticuerpo tiene la particularidad de estar unido a una enzima (puntos verdes), luego que esto ocurre se agrega un reactivo sobre el que reaccione la enzima produciendo un compuesto coloreado. La lectura del color se puede hacer a simple vista o recurrir a un espectrofotómetro que medirá la intensidad del color.

Algunos datos: las enzimas utilizadas suelen ser la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina. La proteína que se usa para bloquear los sitios donde no hay antígeno puede ser simplemente leche.

Lectura de la reacción: la reacción es positiva cuando aparece el color ¿por qué?. La respuesta es fácil si hay unión antígeno-anticuerpo la enzima quedará pegada aun después de varios lavados y al reaccionar con el sustrato virará al azul. Si la reacción es negativa es simplemente porque no hubo unión antígeno-anticuerpo y los lavados intermedios se llevaron el anticuerpo suelto no unido.

 

 Figura 9.5 Fotografía de una placa de ELISA revelada para la enzima

 

 

 

 

ELISA indirecto

 

En la Figura 9.5 se muestra un esquema de un ELISA indirecto.

 

 

Figura 9.5.

 

 

En esta reacción se usan dos tipos de anticuerpos contra el mismo antígeno, el rojo se pega a la placa y sirve de anclaje al antígeno, el segundo es para revelar la presencia del antígeno ya que se encuentra unido a una enzima u otro reactivo que pueda ser revelado. Si el antígeno se pegó al anticuerpo dará positivo porque el segundo anticuerpo también se pegará. La reacción dará negativa si los anticuerpos usados primero no se unieron al antígeno.

 

 

Reacciones de precipitación antígeno-anticuerpo

 

 

A veces cuando un anticuerpo soluble reacciona con un antígeno soluble y se forma el complejo antígeno-anticuerpo se produce un precipitado. Estos precipitados pueden visualizarse en geles de agarosa por la técnica de inmunodifusión. Les dejamos el ejercicio de averiguar en qué consisten esas técnicas de difusión simple o doble y pasaremos a explicar una técnica moderna conocida con el nombre de Western blot. Esta es una de las técnicas de mayor uso en el diagnóstico de infección por el virus HIV aunque no se trata de una aplicación única, se la usa en diagnóstico clínico y en investigación. Este ensayo también permite determinar el peso molecular de una proteína y medir la concentración relativa de una proteína en una muestra.

 

Western Blot (inmunotransferencia de proteínas)

 

En estos ensayos el antígeno es sometido primeramente a una electroforesis y luego es transferido a un tipo de papel o membrana de ciertas características (nitrocelulosa u otras), de modo que el papel es la fase sólida  a la que se une el antígeno. La figura 9.6 muestra esquemáticamente el método.

 

 

 

Veamos los pasos sucesivos de la reacción:

 

1)      Las proteínas son separadas en una electroforesis en un gel donde se sembró la mezcla de proteínas (electroforesis en gel). En general se utiliza la técnica de SDS-PAGE (ver explicación en el glosario).

 

2)      Las proteínas se transfieren (mediante el uso de otra electroforesis o por capilaridad) al papel de nitrocelulosa, se puede observar que se mantiene el patrón de las proteínas, es decir el número de bandas y su posición.

 

3)      El papel de nitrocelulosa se incuba con una solución de proteínas bloqueante, por ejemplo con leche, para que cubra o se pegue en toda la superficie de la nitrocelulosa libre. Luego se agrega a la solución un anticuerpo que se unirá a una de las proteínas, este anticuerpo lleva pegada una enzima (recuerden el ELISA) o un colorante. Aunque por ahora no se ve nada.

 

4)      La localización de la banda a la que se unió el anticuerpo se realiza cuando se incuba con una solución del sustrato para esa enzima que lo convierte en un producto coloreado visible a simple vista y que se puede fotografiar si uno desea guardar una copia de los resultados.

 

 

Conclusión:

 

            El uso de los anticuerpos como reactivos biológicos ha permitido el avance de un gran número de investigaciones y ha encontrado inmediata aplicación en el campo del diagnóstico de numerosas enfermedades.

 

Glosario:

 

Afinidad: Es una medida de la constante de unión entre un solo sitio de combinación del antígeno con un determinante antigénico monovalente presente en el anticuerpo.

 

Aglutinación: Es la agregación de antígenos de antígenos particulados por medio de anticuerpos. El término se aplica a los glóbulos rojos, las acterias o partículas inertes recubiertas de antígeno.

 

Anticuerpos: Son proteínas del suero que se forman en respuesta a la inmunización.

 

Antígeno: Cualquier material extraño que se une en forma específica a anticuerpos específicos o a linfocitos específicos. Los antígenos pueden ser también inmunógenos si son capaces de disparar una respuesta inmune o haptenos si no lo hacen.

 

Centrífuga: Máquina que separa los distintos componentes de una mezcla por la acción de la fuerza centrífuga. Ésta es una fuerza de inercia que se manifiesta en todo cuerpo hacia fuera cuando se le obliga a describir una trayectoria curva. Es igual y contraria a la centrípeta.

 

Dominios: Cuando se estudia la estructura terciaria de una proteína se encuentran regiones de plegamiento independiente denominadas dominios  que se caracterizan por tener funciones específicas.

 

Electroforesis: Si se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene una molécula con carga neta (+ o -), ésta migrará a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamaño y su forma. Esta técnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de moléculas cargadas (proteínas, ácidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidón o poliacrilamida). Generalmente se realiza la técnica de SDS-PAGE que consiste en agregar a la mezcla de corrida el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) este detergente elimina la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas y deja solo la cadena primaria de aminoácidos. PAGE: es la abreviatura de electroforesis en gel de poliacrilamida.

 

Enzima: Proteína que cataliza específicamente cada una de las reacciones bioquímicas del metabolismo.

 

Espectrofotómetro: Aparato que mide la cantidad de luz absorbida por una sustancia en disolución y compara intensidades espectrales con respecto a una longitud de onda.

 

Hemólisis: liberación de la hemoglobina de dentro del GR por ruptura de la membrana que lo forma.

 

Hibridoma: Una célula híbrida que resulta de la fusión de una célula secretora de anticuerpos con una célula maligna. La progenie (descendencia) produce (secreta)  anticuerpos sin estimulación y prolifera continuamente tanto in.vitro como in vivo.

 

Sustrato: se denomina así a la solución que contiene un compuesto sobre el cual actuará una enzima: Por ejemplo: las enzimas que cortan las cadenas de proteínas como la papaína tienen como sustrato una solución de proteína.

 

Virar: se refiere a la propiedad de un líquido de cambiar de color. Por ejemplo: hay colorantes que tienen un color en medio ácido y lo cambian en medio alcalino.

 

 * Este curso es una contribución de Química Viva educativa  (e-Lab) a la propagación del conocimiento científico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

 

 

Volver al menú de selección de capítulo.
 
  


ISSN 1666-7948
www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

Revista QuímicaViva
Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 
quimicaviva@qb.fcen.uba.ar