ISSN 1666-7948
www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar
Número 3, año 3, septiembre 2004
quimicaviva@qb.fcen.uba.ar
|
|
Revista
QuímicaViva Número 3, año 3, septiembre 2004 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |
Bioplásticos:
una alternativa ecológica.
Alejandra
de Almeida, Jimena A. Ruiz, Nancy I. López y M. Julia Pettinari*
Laboratorio de Ecología y Genética Bacteriana, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires
Recibido 13 de julio de 2004/ Aceptado 20 de
agosto de 2004
Resumen
Los
polihidroxialcanoatos (PHA) son sintetizados por muchas
especies de distintos géneros bacterianos en condiciones de crecimiento
caracterizadas por exceso en la fuente carbonada y limitación de otros
nutrientes como nitrógeno o fósforo. Estos polímeros se acumulan en gránulos
intracitoplasmáticos y son utilizados como fuente de carbono y energía en
condiciones de escasez nutricional. Resultados obtenidos en el laboratorio nos
permitieron demostrar que la degradación de PHA cumple un papel muy
importante en la supervivencia bacteriana y en los mecanismos de resistencia
al estrés, en condiciones de baja concentración de nutrientes.
A
su vez, estos
biopolímeros son termoplásticos y poseen propiedades similares a las de los
plásticos derivados del petróleo.
Pueden
ser totalmente degradados por las bacterias que los producen, y por otras
bacterias, hongos y algas. A pesar de las evidentes ventajas de los PHA frente
a los plásticos derivados del petróleo, su uso está muy limitado debido a
su alto costo de producción. Por este motivo, gran parte de las investigaciones
realizadas sobre los PHA en los últimos años se han concentrado en reducir
los costos de producción y aumentar la productividad utilizando diversas
estrategias. Entre ellas se encuentran el rastreo de nuevas cepas productoras,
la optimización de las estrategias de cultivo y la producción de PHA
utilizando cepas de E. coli recombinantes. Todas ellas se están
llevando a cabo actualmente en nuestro laboratorio.
Palabras clave: polihidroxialcanoatos, bioplásticos, bacterias, estrés, supervivencia.
Abstract
Polyhydroxyalkanoates
(PHA) are synthesized by many species of bacteria belonging to different
genera, in growth conditions characterized by an excess of carbon source and a
limitation in other nutrients such as nitrogen or phosphorus. These polymers are accumulated in intracytoplasmatic
granules, and are used as a source of carbon and energy when nutrients are
scarce. Results obtained in our laboratory allowed us to demonstrate that PHA
play a very important role in bacterial
survival and in stress resistance mechanisms in poor nutrient conditions.
These biopolymers are thermoplastics and their properties are similar to those of petroleum-derived plastics. They can be completely degraded by bacteria that produce them, and also by other bacteria, fungi and algae. In spite of the obvious advantages that PHA compared with petroleum-derived plastics, their use is currently limited due to their high production costs. For this reason, most research done on PHA in the last years is focused on reducing production costs and increasing productivity by means of several strategies. Among these strategies are screening for new PHA-producing strains, the optimization of fermentation conditions and the production of PHA using recombinant E. coli strains, all of which are currently being studied in our laboratory.
Key words: polyhydroxyalkanoates, biopolymers, bacteria, stress, survival.
Introducción
Los PHA son polímeros lineales de
(R)-3-hidroxiácidos en los cuales el grupo carboxilo de un monómero forma un
enlace tipo éster con el grupo hidroxilo del monómero siguiente (Figura
1).
Los
PHA se depositan intracelularmente en formas de cuerpos de inclusión y pueden
llegar a representar más del 90% del peso seco celular
(Fig
2).
El
primer PHA descubierto fue el poli(3-D-hidroxibutirato) (PHB), un
homopolímero que fue detectado en la especie Bacillus megaterium en
el año 1925 (7). Posteriormente, se encontraron inclusiones de PHA en una
extensa variedad de especies bacterianas. La progresiva acumulación de los
desechos sólidos, a medida que aumenta la industrialización y el consumo, es
un problema global que comenzó a advertirse en el siglo pasado y se hace cada
vez más angustiante. Uno de los materiales de desecho más persistentes son
los plásticos, que permanecen en la superficie terrestre prácticamente
inalterables por miles de años.
Los
PHA han cobrado una gran importancia durante los últimos años en el campo de
la industria debido a sus propiedades termoplásticas. Por este motivo, han
sido considerados como posibles sustitutos de los plásticos derivados del
petróleo.
Además de sus propiedades termoplásticas, los PHA poseen otras
características interesantes: su biodegradabilidad y el hecho de que pueden
ser producidos a partir de recursos renovables. Su producción fermentativa
utiliza productos derivados de la agricultura como fuente de carbono. En la
naturaleza los microorganismos son capaces de degradar los PHA, mediante la
acción de PHA depolimerasas y PHA hidrolasas extracelulares, hasta CO2
y agua. De esta manera, mientras que los plásticos derivados de hidrocarburos
utilizan las escasas reservas petroquímicas del planeta, la producción de
PHA se basa en la utilización de recursos renovables.
Ante
estas ventajas tan evidentes, ¿por qué no utilizar los PHA en lugar de los
plásticos tradicionales? La respuesta es muy simple: su costo es varias veces
mayor.
En
los años 70 hubo una crisis mundial de petróleo, en la que el precio del
combustible fósil creció mucho. En ese contexto, las investigaciones
alrededor de los PHA florecieron, y la empresa ICI desarrolló un proceso para
producir a escala industrial un
bioplástico que se comercializó bajo el nombre de “Biopol”. Este
polihidroxialcanoato es un copolímero de monómeros de cuatro y cinco
carbonos, denominados hidroxibutirato e hidroxivalerato, respectivamente. El
“Biopol” se producía utilizando la bacteria Ralstonia eutropha
cultivada en un medio con glucosa y propionato como fuentes de carbono. A
pesar de su costo relativamente elevado, el “Biopol” fue utilizado en
varias aplicaciones en algunos países como Alemania.
A
fines del siglo XX el precio del petróleo disminuyó, y de la misma manera
decayó el interés por los PHA. En los últimos años esta tendencia se ha
revertido. Además de producirse un aumento en el precio del petróleo, se ha
tomado mayor conciencia de que las reservas se están agotando de manera
alarmante. Las estimaciones varían mucho, ya que la información que
suministran los países que tienen reservas de petróleo no siempre es
confiable, pero lo más probable es que comiencen a agotarse en las próximas
décadas. Ante esta perspectiva, las investigaciones que involucran a los
plásticos obtenidos de otras fuentes han tomado un nuevo impulso, y los
polihidroxialcanoatos aparecen como una alternativa altamente prometedora.
Por
otro lado, los residuos plásticos se acumulan en grandes cantidades y su
degradación es lenta. En un estudio reciente publicado en la revista “Science”
se observó que hay partículas de plástico presentes en los mares de
todo el mundo (24). El reciclado de los plásticos aliviaría un poco la
situación, pero sólo en parte. Por este motivo, el reemplazo de los
plásticos no degradables por biopolímeros totalmente degradables obtenidos a
partir de fuentes de carbono renovables sería una solución mucho
más completa para los diferentes aspectos de este problema. Sin embargo, el
precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado alto como para que puedan
desplazar a los plásticos tradicionales. Debido a esto, es necesario diseñar
estrategias para obtener polihidroxialcanoatos a un costo similar.
El
precio final de los biopolímeros depende de varios factores, entre ellos los
costos de la producción, el
rendimiento de polímero obtenido y los costos de procesamiento. Existen
actualmente varios enfoques para lograr producir PHA a precios competitivos.
Las plantas serían la alternativa ideal para la producción de biopolímeros,
debido a la posibilidad de cultivarlas en grandes cantidades utilizando la
fuente de energía más económica que existe: la luz solar. Se han logrado
introducir y expresar los genes bacterianos necesarios para la síntesis de
PHA en plantas de cultivo (18), lográndose obtener pequeñas cantidades de polímero.
Sin
embargo, para poder utilizar plantas para la producción de PHA es necesario
solucionar una serie de problemas. Por ejemplo, el metabolismo vegetal está
altamente compartimentalizado, lo cual complica la tarea, ya que es necesario
que los genes pha se expresen en el compartimiento celular que contiene
la mayor concentración de acetil-CoA, y al mismo tiempo impedir que se vea
afectado el crecimiento de la planta (10) .
Producción
de PHA en microorganismos
Para poder desarrollar un proceso de producción de PHAs mediante
fermentación utilizando microorganismos
es necesario optimizar el rendimiento y la facilidad de purificación del polímero,
y fundamentalmente abaratar el costo de los sustratos utilizados para su
obtención.
Los primeros procesos desarrollados
para la producción de PHA en microorganismos se realizaron mediante
fermentación utilizando a la bacteria Ralstonia eutropha, la cual es
capaz de producir PHB a partir de glucosa, o polihidroxibutirato-valerato (PHBV)
a partir de glucosa y propionato, sustratos cuyo alto costo incidía en el
precio final del polímero obtenido.
Actualmente,
existen varios procesos desarrollados para la producción de PHA por
fermentación a partir de sustratos económicos: en Brasil se producen a
partir de melaza de caña, y en Estados Unidos y Corea a partir de
varios sustratos de origen vegetal.
Importancia
de los PHA en la supervivencia bacteriana
La
gran mayoría de los seres vivientes acumulan diferentes sustancias de
reserva cuando existe un exceso de recursos en su entorno. Cuando los
nutrientes se vuelven escasos, son utilizadas para poder sobrevivir.
Entre
las sustancias de reserva acumuladas por los organismos procariotas se
encuentran los polihidroxialcanoatos (PHA). Estos polímeros son acumulados en
gránulos intracelulares por numerosas especies de bacterias, en condiciones
limitantes de nutrientes esenciales para el crecimiento (tales como nitrógeno
combinado, azufre o fosfatos) y exceso en la fuente de carbono (23). Cuando la
fuente de carbono externa se agota, o si el nutriente limitante es
suministrado nuevamente, el PHA es depolimerizado y posteriormente
metabolizado como fuente de carbono y energía (12).
La
utilización de dicho polímero es considerada una estrategia desarrollada por
las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes. Los
PHA son utilizados como fuente de carbono y energía en condiciones de escasez
de nutrientes (11), como fuente de carbono y energía para el enquistamiento y
la esporulación (1), para la degradación de compuestos tóxicos (4), y como
fuente de poder reductor (5).
Las
investigaciones realizadas sobre los PHA en los últimos años apuntan a
reducir los costos de producción y aumentar la productividad utilizando
diversas estrategias. Para lograr estos objetivos es fundamental optimizar el
proceso de fermentación. Trabajos recientes han demostrado la importancia del
estudio de la respuesta general a estrés para el desarrollo de estos procesos
(3, 13), señalando la necesidad de realizar tanto
estudios básicos como aplicados para el diseño de
procesos biotecnológicos que involucran pasos de fermentación.
En
nuestro laboratorio se llevan a cabo estudios orientados hacia estos
objetivos, que incluyen el rastreo de nuevas cepas productoras, la optimización
de las estrategias de cultivo y la producción de PHA utilizando cepas de E.
coli recombinantes. Por otra parte, se realizan investigaciones
relacionadas con la importancia del polímero en la supervivencia bacteriana y
en los mecanismos de respuesta a estrés. Parte de estos estudios se presentan
a continuación.
Síntesis de PHA en Azotobacter sp. FA8
Azotobacter sp. FA8 es una bacteria productora de PHB aislada de muestras
de suelo. Esta cepa puede utilizar sacarosa o melazas de caña, un subproducto
de la obtención de azúcar de caña muy barato en nuestro país y en los
diferentes países de la región, para producir PHB. Otra característica
importante de este microorganismo es que no forma cápsula, lo cual significa
que no deriva la fuente carbonada para la síntesis de exopolisacáridos.
En
esta bacteria el polímero se sintetiza mediante un camino metabólico que
involucra tres enzimas: una b-cetotiolasa,
que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una
acetoacetil-CoA reductasa, que convierte este compuesto en 3-hidroxibutiril-CoA,
y una polimerasa, que polimeriza los monómeros. Este camino metabólico es el
que utilizan la mayoría de las bacterias productoras de PHB, tales como R.
eutropha. En Azotobacter
sp.
FA8 estas enzimas están codificadas por los genes phaB, phaA y phaC,
que han sido clonados y caracterizados en nuestro laboratorio (16).
Figura 3. Esquema de la síntesis
de PHB en Azotobacter sp. FA8.
Existen otras proteínas involucradas en la regulación de la biosíntesis
del polímero y en la formación de los gránulos intracitoplasmáticos. Se
han descripto varias proteínas estructurales. Una de ellas son las fasinas,
que se encuentran asociadas a los gránulos de PHA. Estas proteínas podrían
afectar el tamaño y la pureza de los gránulos, ya que son importantes para
la forma que el gránulo adquiere intracelularmente e impiden que otras proteínas
puedan asociarse inespecíficamente, lo cual simplifica la purificación del
polímero. La interacción entre las proteínas asociadas a los gránulos es
prácticamente desconocida en todas las especies estudiadas hasta ahora. Sin
embargo, es probable que las proteínas no catalíticas interactúen con las
proteínas enzimáticamente activas, como las sintasas y las depolimerasas,
afectando la velocidad de producción de PHA.
Además
de los genes estructurales, phaB, phaA y phaC, en la misma región
del genoma de Azotobacter sp. FA8 se han encontrado otros genes
asociados al metabolismo de los PHA. Entre ellos se encuentran, el gen phaP,
el cual codifica para una proteína asociada a los gránulos de PHA, y los
genes phaF y phaR, que poseen una posible función
regulatoria de la síntesis y acumulación de PHA y son homólogos a genes
involucrados en la producción de PHA en otros microorganismos (17). Por otro
lado, también se ha identificado una secuencia de inserción completa (ISAzspI)
y los restos de otra (ISr), situadas a ambos lados del grupo formado por los
genes phaF, phaP y phaR. Esto sugiere la posibilidad de
que estos genes hayan sido transferidos a Azotobacter a partir de otro
microorganismo mediante un mecanismo que involucra secuencias de inserción,
similar al observado en la transferencia de islas de patogenia.
Figura 4. Organización genética
de la región pha de Azotobacter sp. FA8.
Las flechas indican el sentido de la
transcripción. La barra representa una longitud de 1000 pares de bases (pb).
Producción
de PHA en Escherichia coli recombinante
Los
productores naturales de PHA, como Azotobacter sp. FA8,
se han adaptado a la acumulación de estos polímeros durante la
evolución, pero normalmente tienen un tiempo de generación largo y
temperaturas de crecimiento relativamente bajas. Además, son difíciles de
lisar y poseen enzimas que degradan el polímero acumulado. Estas características
dificultan su uso en la producción industrial de los biopolímeros.
Entre
las cepas bacterianas comúnmente utilizadas en procesos biotecnológicos, E.
coli es el microorganismo mejor conocido, ya que su metabolismo ha sido
extensivamente estudiado y caracterizado. Debido a esto, es un microorganismo
modelo, ideal para su uso en fermentaciones. Además, debido al gran número
de herramientas disponibles para realizar manipulaciones genéticas, es el
organismo adecuado para realizar ensayos previos al traspaso de los genes a
plantas. E. coli no posee la
capacidad de sintetizar o degradar PHA pero crece rápido y es fácil de lisar.
Se han expresado los genes pha de varias especies bacterianas en
E.coli, obteniéndose buenos
rendimientos del polímero. Asimismo, al no poseer enzimas que degraden a los
PHA, permite la acumulación de polímero de alto peso
molecular.
Los
genes necesarios para la síntesis de PHB de Azotobacter sp. FA8, phaB,
phaA y phaC, han sido
clonados y caracterizados en el laboratorio y transferidos a una cepa de E.
coli adecuada para la producción del polímero.
Para
lograr una buena acumulación del polímero en E.coli
recombinante es necesario utilizar vectores de expresión estables con un alto
número de copias, pues uno de los mayores desafíos del sistema es la expresión
estable y sostenida de los genes pha. Para esto, se construyó un plásmido recombinante
introduciendo los genes pha de Azotobacter sp FA8 bajo la regulación del promotor lactosa en un
vector de expresión de alto número de copias. Este plásmido se transfirió
a E. coli y permitió la obtención de PHB en la cepa recombinante a
partir de glucosa. La cepa utilizada también degrada lactosa, por lo que se
analizó la producción del polímero utilizando lactosa y también lactosuero
en un medio salino, obteniéndose una buena cantidad de polímero en ambos
casos. En este momento se están realizando las pruebas piloto para aumentar
la escala del proceso, con el objeto de desarrollar un proceso económicamente
atractivo de producción del polímero, ya que el medio de cultivo utilizado
solamente contiene sales y lactosuero, un desecho de la industria lechera,
como fuente de carbono. La utilización del lactosuero tiene una ventaja
adicional, ya que se trata de un desecho contaminante cuya eliminación
adecuada involucra un costo elevado. Su utilización como sustrato de una
fermentación cuyo producto es una sustancia con un buen valor económico
implica entonces un doble beneficio.
Figura 5. Trozos de
polihidroxibutirato (PHB)
extraído de cultivos bacterianos.
