QuímicaViva - Ver resumen

EXPRESIÓN DE TOXINAS CRY RECOMBINANTES DE BACILLUS WIEDMANNIIBIOVAR THURINGIENSIS FCC41 MEDIANTE DOS METODOLOGIAS DE CLONADO

LOPEZ, Rocio de La Paz | GIL, Maria Florencia | BERÓN, Corina

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN BIODIVERSIDAD Y BIOTECNOLOGÍA (INBIOTEC-CONICET) Y FIBA

Introducción y Objetivos:
Los agentes entomopatógenos son herramientas novedosas y con gran potencialpara ser utilizadas dentro de los sistemas de manejo integrado de insectos plaga y vectores. Uno de los agentesmás utilizados es la bacteria Bacillus thuringiensis debido a que durante la esporulación forma inclusionesproteicas, principalmente formadas por proteínas Cry, que poseen acción tóxica específica contra especies dedistintos órdenes de insectos, entre los que se encuentran algunas especies de mosquitos vectores deimportancia en salud pública. El manejo de las poblaciones de estos dípteros se ha realizado durante años pormedio de insecticidas químicos o mediante productos formulados a base de Bacillusthuringiensis subesp. israelensis (Bti). Sin embargo, durante los últimos años se ha observado el desarrollo deresistencia por parte de algunas poblaciones de mosquitos, por lo que la búsqueda de nuevos agentes decontrol es fundamental. Bacillus wiedmannii biovar thuringiensis FCC41 es una cepa nativa con actividadmosquitocida contra las especies Aedes aegypti, Aedes (Ochlerotatus) albifasciatus, Culex pipiens, Culexquinquefasciatus, y Culex apicinus. FCC41 posee 6 proteínas Cry identificadas como Cry4-like1, Cry4-like2,Cry52-like1, Cry52-like2, Cry24Ca y Cry41-like. El objetivo de este trabajo fue analizar la expresión individualde cada una de estas toxinas.
Materiales y Métodos:
Los genes cry fueron amplificados mediante la técnica de PCR e incorporados en elvector de expresión específico pSTAB. Las construcciones fueron abordadas por dos metodologías de clonadodiferente. Se utilizó un sistema tradicional mediante enzimas de restricción y para la proteína Cry4-like1, la cualno tiene sitios de restricción compatibles con el vector, se utilizó el método “Advanced Quick Assembly”(AQUA). Es una técnica novedosa que no requiere el uso de kit, enzimas de restricción o preparación dereactivos, la misma aprovecha el procesamiento intrínseco in vivo de fragmentos de DNA lineales con regionescortas de homología de 16 a 32 pb mediadas por Escherichia coli. Los plásmidos obtenidos fueron introducidosen la cepa acristalífera 4Q7 de B. thuringiensis por medio de la técnica de electroporación.
Resultados:
Se obtuvieron cepas recombinantes portadoras de las secuencias de interés, las cuales mostraronperfiles de crecimiento y esporulación similares entre sí. La presencia de las proteínas expresadas se detectópor SDS-PAGE y mediante microscopia electrónica de barrido.
Conclusiones:
Los dos métodos fueron eficaces para clonar y expresar genes cry en sistemas heterólogos,estos podrán ser usados para estudiar la acción mosquitocida de cada toxina de manera individual y sinérgica,para ser empleadas en el control de poblaciones de mosquitos de importancia sanitaria.