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ROL DIFERENCIAL DE LAS PROTEINAS FLIL EN LOS DOS SISTEMAS FLAGELARES DE BRADYRHIZOBIUM DIAZOEFFICIENSUSDA 110

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, IBBM--CONICET, FAC. CS EXACTAS, UNLP

Introducción y Objetivos:
Los flagelos son estructuras especializadas, altamente complejas, que permiten la propulsión de las bacterias en distintos ambientes. La natación es un tipo de movimiento mediado por flagelos, la cual consiste en el movimiento de células individuales en medio líquido. B. diazoefficiens es el único rizobio descripto que posee dos sistemas flagelares: uno subpolar y otro lateral, los cuales aportan al movimiento de natación. Ambos sistemas están compuestos por grupos de genes distintos, que se regulan de manera independiente y, a diferencia de otras especies, se expresan simultáneamente en medio líquido suplementado con arabinosa. Las proteínas que forman la estructura flagelar se encuentran bien caracterizadas en bacterias modelo. Sin embargo, la función precisa de una pequeña proteína estructural llamada FliL, se desconoce. En E. coli, FliL se localiza en la base de la estructura flagelar y parece contribuir a la estabilidad del motor cuando aumenta la fuerza de torque. Para estudiar la función de FliL en la natación de B. diazoefficiens USDA 110, se obtuvieron mutantes delecionales en los genes fliLS y fliLL, asociados al flagelo subpolar y lateral respectivamente. Además, para eliminar interferencias entre los sistemas flagelares, se delecionó fliL sobre cepas carentes de los filamentos del sistema flagelar subpolar ("DELTA"fliC) y lateral ("DELTA"lafA).
Materiales y Métodos:
Las cepas mutantes se obtuvieron utilizando técnicas clásicas de biología molecular. La movilidad en medio semisólido se evaluó en medio mínimo con 0,3% agar. La velocidad de nado se adquirió mediante el análisis de bacterias filmadas en medio líquido con el software Move-tr/2D. El efecto de la viscosidad se ensayó adicionando polivinilpirrolidona (PVP) al medio de cultivo. Las flagelinas y el ARNm se extrajeron de medios líquidos y agarizados, y se analizaron mediante SDS-PAGE y RT-qPCR, respectivamente.
Resultados:
En agar semisólido se observó una mayor movilidad de la mutante "DELTA"fliLS respecto a la cepa salvaje, mientras que "DELTA"fliLL nadó menos que ambas. En relación a ello, proteínas extracelulares extraídas de la cepa "DELTA"fliLS mostraron mayor intensidad de señal de las flagelinas del sistema lateral (LafA) respecto a las subpolares. Esta mayor cantidad de LafA en la cepa "DELTA"fliLS se correlacionó con un aumento del ARNm del regulador maestro del sistema lateral (lafR), y también de sus genes diana. Al caracterizar la cepa "DELTA"lafA/"DELTA"fliLS, se observó una reducción en la velocidad de nado y en el diámetro del halo de natación en medio semisólido respecto a la cepa parental "DELTA"lafA. Por el contrario, al evaluar ambos parámetros en la cepa "DELTA"fliC/"DELTA"fliLL, no se observó movilidad alguna.
Conclusiones:
FliLL resultaría esencial para el correcto funcionamiento del sistema flagelar lateral, mientras que FliLS posee un rol importante pero no determinante. A su vez, la ausencia de FliLS en la mutante simple indicaría una señalización cruzada entre ambos sistemas flagelares, conexión que, de corroborarse, no ha sido descripta en esta especie bacteriana.