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UNA NUEVA NAD(P)H DESHIDROGENASA DE XANTHOMONAS CITRI SUBSP. CITRI INVOLUCRADA EN LA TOLERANCIA AL ESTRÉS SALINO Y OXIDATIVO

BARCAROLO, María Victoria | GARAVAGLIA, Betiana | GOTTIG, Natalia | OTTADO, Jorgelina

INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO (IBR-CONICET, FBIOYF, UNR)

cítricos, enfermedad mundial que afecta a variedades cítricas provocándoles una disminución en la producción y calidad de los frutos. Durante el ciclo de vida de Xcc como epífita sobre la superficie del tejido vegetal, está expuesta a condiciones ambientales desfavorables entre ellas, baja disponibilidad de agua y estrés osmótico. En un estudio de proteómica realizado previamente evaluamos la adaptación de Xcc en condiciones de estrés salino generado por NaCl 0,25 M. Una proteína homóloga a una NAD(P)H deshidrogenasa (DH), presentó una abundancia de 30 veces en bacterias sometidas a estrés salino. El objetivo de este trabajo consiste en dilucidar la función de la proteína DH en la interacción planta-patógeno y en la adaptación de Xcc en condiciones de estrés salino y oxidativo.
Materiales y Métodos:
Mediante qRT-PCR evaluamos los niveles de expresión de la DH y, para caracterizar la funcionalidad de esta proteína generamos una mutante, XccDH- por doble evento de recombinación y se complementó conjugando pBBR1MCS-2:DH, XccDH-c. A través de curvas de crecimiento evaluamos el comportamiento de las bacterias en NaCl 0; 0,25 y 0,5 M. Para analizar la participación de la DH en la tolerancia a estrés oxidativo, incubamos las bacterias en H202 25 mM. La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los extractos bacterianos luego del tratamiento con H202 25 mM, NaCl 0,25 y 0,5 M, se cuantificaron utilizando la sonda fluorescente diacetato 2‟,7‟-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) y mediante el ensayo de “sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico” (TBARS).
Resultados:
Al evaluar los niveles de expresión de la DH en NaCl 0,25 M observamos una inducción de 3.3 veces (p<0,05) respecto al control. Por otra parte, analizamos el crecimiento bacteriano de Xcc, XccDHy XccDH-c y observamos que disminuyó con el aumento de la concentración de NaCl, sin observar diferencias significativas entre las cepas en estudio. Al caracterizar la participación de esta proteína en el proceso de patogenicidad, no observamos diferencias en las lesiones de la enfermedad producidas por las cepas en estudio. Sin embargo, cuando se evaluó la sobrevida epifítica, XccDH- presentó una tasa de sobrevida menor sobre el tejido vegetal con respecto a Xcc (p<0,05). En condiciones de estrés oxidativo XccDH- mostró mayor sensibilidad al oxidante (p<0,05), y al cuantificar ROS en los extractos bacterianos, XccDH- mostró un aumento significativo de los niveles de ROS (p<0,05), sugiriendo que la proteína DH estaría involucrada en el control de la acumulación de ROS intracelular.
Conclusiones:
Con los resultados obtenidos hasta el momento, se logró caracterizar la enzima NAD(P)H deshidrogenasa, una nueva proteína involucrada en los mecanismos de adaptación bacteriana frente a condiciones ambientales desfavorables, que determinan el éxito del proceso de patogenicidad.