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CARACTERIZACIÓN DE UNA MUTANTE DE HALOMONAS TITANICAE KHS3 POR INTERRUPCIÓN EN EL GEN POLIHIDROXIALCANOATO SINTASA PHAC1

RODRIGUEZ, Ailen Natali 1 | REDERSDORFF, Ingrid2 | STUDDERT, Claudia1 | HERRERA SEITZ, María Karina2

INSTITUTO DE AGROBIOTECNOLOGÍA DEL LITORAL 1; INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS, IIB CONICET UNMDP, FCEYN 2

Introducción y Objetivos:
Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva que son sintetizados por muchos microorganismos y pueden ser utilizados en la generación de bioplásticos. Halomonas titanicae KHS3 (Ht KHS3) es una cepa ambiental que fue aislada del agua del puerto de Mar del Plata por su capacidad de crecer utilizando fenantreno como única fuente de carbono y responder quimiotácticamente a dicho sustrato. Se secuenció su genoma completo, y se identificaron genes involucrados en la síntesis de polihidroxialcanoatos, entre los que se encuentran dos genes de tiolasa (phaA), uno de acetoacetil CoA reductasa (phaB), dos de PHA sintasa (phaC). Además se identificaron tres genes que codifican proteínas tipo fasina que recubren los gránulos de PHAs (phaP), un gen homólogo a una proteína reguladora de la síntesis de PHAs (phaR) y dos genes de PHA depolimerasas (phaZ). Todos estos genes se encuentran dispersos en el genoma, y sólo los genes phaC1 y phaP1 se encuentran adyacentes uno de otro. En nuestro laboratorio hemos demostrado que Ht KHS3 es capaz de acumular más del 50% de su peso seco de polihidroxibutirato (PHB), cuando crece tanto en medios con 1% de glucosa como fuente de carbono, como cuando se la priva de nitrógeno en medios que contienen glicerol o fenantreno como fuente de carbono. El objetivo de este trabajo es analizar el rol de las PHA sintasas codificadas en el genoma en la acumulación de PHB en las distintas condiciones.
Materiales y Métodos:
Se obtuvo una mutante de Ht KHS3 (SF18) por interrupción en el gen de phaC1, mediante recombinación homóloga de un fragmento interno del gen clonado en un plásmido suicida. Se realizaron curvas de crecimiento en distintas fuentes de carbono (glucosa, glicerol y fenantreno) de la cepa WT y de la mutante. La acumulación de PHAs en estas curvas se determinó por diferentes técnicas: peso seco, tinción de gránulos de PHB con Nile Blue y su observación en microscopio o lupa de fluorescencia, tratamiento con hipoclorito de sodio y relación de turbidez.
Resultados:
En curvas de crecimiento realizadas en medio con glucosa 1% como fuente de carbono, se observó una notable reducción de la velocidad de crecimiento de la mutante, así como una reducción del 50% en la densidad máxima alcanzada en fase estacionaria. Se observó que la mutante no es capaz de acumular PHB en cultivos crecidos en glucosa como fuente de carbono, y en cultivos crecidos en glicerol al ser privado de nitrógeno. En cambio, mostró una capacidad prácticamente inalterada de acumular PHB en cultivos crecidos en fenantreno y sometidos a la privación de nitrógeno.
Conclusiones:
En conjunto, nuestros resultados indican que la sintasa PhaC1 tiene un rol fundamental en la acumulación de PHB que se produce en cultivos crecidos a expensas de glucosa o glicerol. Pero no cumple un papel esencial en la síntesis de PHAs en cultivos de fenantreno. Adicionalmente, la reducción en la velocidad de crecimiento de la mutante sugiere un rol importante de esta sintasa en la fisiología de este microorganismo.