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IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS SUPERÓXIDO DISMUTASAS EN AISLAMIENTOS ALTOANDINOS DEL GÉNERO ACINETOBACTER

STEIMBRUCH, Bruno | SARTORIO, Mariana | DI CAPUA, Cecilia | REPIZO, Guillermo | CORTEZ, Nestor

INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO IBR (CONICET & UNR)

STEIMBRUCH, Bruno | SARTORIO, Mariana | DI CAPUA, Cecilia | REPIZO, Guillermo | CORTEZ, Nestor INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO IBR (CONICET & UNR)
Introducción y Objetivos:
Las Lagunas de Altura de la Puna Andina (LAPA´s) se encuentran en el noroeste de Argentina y se caracterizan por estar expuestas a una alta intensidad de radiación UV, amplias fluctuaciones térmicas y por presencia de metales pesados como arsénico. Acinetobacter sp. Ver3 es un poliextremófilo aislado de las LAPA´s que presenta resistencia a la radiación UV y a pro-oxidantes como H2O2 y metilviológeno (MV).El análisis del genoma secuenciado de Ver3 reveló la existencia de dos genes codificantes para actividad superóxido dismutasa (SOD): una citosólica de tipo Fe/Mn (SodB) y otra de tipo Cu/Zn (SodC) que posee un péptido señal de direccionamiento a periplasma.
Materiales y Métodos:
Los genes codificantes para SODs de tipo Fe/Mn (sodb) y CuZn (sodc) de A. ver3 fueron amplificados por PCR y clonados en vectores de expresión de la serie pET para la posterior caracterización de las proteínas recombinantes. Para evaluar el contenido de metal de FeMnSOD, se realizaron medidas por ICP-MS en LB y BM2 junto con ensayos de inhibición con H2O2 . Mediante el uso de anticuerpos policlonales se evaluó la expresión de sodb en respuesta a diferentes condiciones de estrés. El gen sodc junto con su región promotora fue amplificado por PCR y posteriormente clonado en el vector pMBLe. Para evaluar su respuesta frente a agentes prooxidanes mediante recuento de UFC, se utilizó como modelo de estudio cepas A. baylyi ADP1 transformadas con pMBLeSOD. Las mismas fueron crecidas en LB hasta alcanzar una DO de 0.6 para luego ser tratadas con agentes prooxidantes como MV, H2O2 y Riboflavina + TEMED como agente generador de O2- en presencia de luz.
Resultados:
Si bien estudios filogenéticos ubican a SodB dentro del grupo de las SODs de tipo Fe, las medidas de contenido metálico en la proteína recombiante. por ICP-MS de indicaron que el contenido de Mn++ aumenta considerablemente si este se suplementa a BM2 con el metal, sugiriendo así que se trata de una SOD de tipo cambialística. El gen sodC conteniendo 300 pb corriente arriba fue amplificado por PCR y clonado en el vector pMBle replicativo para Acinetobacter, obteniéndose el plasmido pMSodC. Células de A. baylyi ADP1 transformadas con pMSodC se hicieron crecer en LB y fueron tratadas con MV, H2O2 y Riboflavina + TEMED, siendo este último un agente generador de O2-; extracelular en presencia de luz. ADP1 transformada con pMSodC presento un mayor desarrollo con respecto a la cepa control frente al agregado de Riboflavina + TEMED indiacando la función de SodC en la defensa frente al superóxido extracelular.
Conclusiones:
Acinetobacter sp. Ver3 posee dos superóxido dismutasas (SODs). Una enzima es del tipo Fe/Mn y posee carácter cambialístico, modificando su contenido metálico en función de la oferta del medio de cultivo. Funciona detoxificando el superóxido intracelular subproducto de la respiración aeróbica. La otra SOD es del tipo Cu.Zn y de localización periplásmica. Su función detoxificadora es manifiesta ante la presencia de superóxido extracelular. La presencia de SodC en A. baylyi ADP1 otorga a la célula huésped una mayor velocidad de crecimiento en aerobiosis.