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EFECTO DE RAPD EN EL DESARROLLO DE LA MATRIZ DEL BIOFILM DE RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICIAE 3841

TARSITANO, Julián 1 | RUSSO, Daniela1 | ALONSO, Leonardo2 | ZORREGUIETA, Angeles1

IIBBA-CONICET Y FUNDACION INSTITUTO LELOIR 1; NANOBIOTEC Y CONICET-UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES 2

Introducción y Objetivos:
Rhizobium leguminosarum produce un polisacárido acídico que queda en parte retenido sobre la célula como polisacárido capsular (CPS) y que mayormente se libera al medio extracelular como exopolisacárido (EPS). Las proteínas de la familia Rap, secretadas por el sistema de secreción tipo I PrsDE participan en la formación de un biofilm maduro, procesando las cadenas de polisacárido o afectando las propiedades adhesivas de la bacteria. Comparten al menos un dominio Ra (por Rhizobium adhering) y con excepción de RapA2 (formada únicamente por dos dominios Ra) poseen otro dominio específico. En estudios previos demostramos que RapA2 es una lectina que une calcio capaz de interactuar específicamente con el CPS y el EPS de R. leguminosarum, indicando que uno o ambos dominios Ra exhiben actividad de lectina. Además, la ausencia o el aumento de RapA2 en el medio extracelular modificaron las propiedades de la matriz del biofilm. Por otro lado, RapD, posee un dominio Ra con mayor similitud al segundo dominio Ra (Ra2) de RapA2 y un dominio específico C-terminal de función desconocida. Nuestra hipótesis es que la interacción de RapD con el CPS y/o EPS, a través del dominio Ra2 cumple una función en la modulación de la estructura de la matriz del biofilm. El objetivo de este estudio es comprender la función de RapD en el desarrollo del biofilm.
Materiales y Métodos:
Utilizando R. leguminosarum bv. viciae 3841 como modelo se generó una cepa mutante por deleción del gen rapD así como también una doble mutante "Delta"rapD y "Delta"rapA2. Se analizó mediante ELISA la interacción entre RapD recombinante y el EPS proveniente de distintas cepas así como la dependencia del calcio en esta unión. Los perfiles del EPS producido por los diferentes contextos genéticos se analizaron por HPLC, utilizando una columna Superosa 6 HR 10/30. Se estudió la capacidad de RapD recombinante de formar estructuras multiméricas mediante SLS.
Resultados:
RapD recombinante fue capaz de interaccionar con el EPS en presencia de calcio. Además, la ausencia de RapA2 extracelular en la preparación (cruda) de EPS afecta la interacción entre RapD y el EPS. Más aún, el EPS producido por la doble mutante "Delta"rapD "Delta"rapA2 mostró un perfil diferente en comparación con el EPS proveniente de las simples mutantes. Estas observaciones indican una interacción funcional entre ambas proteínas Rap. Por último, RapD fue capaz de formar estructuras multiméricas en presencia de calcio, lo cual sugiere que RapD, a diferencia de RapA2, se une al EPS como multímero.
Conclusiones:
RapD es una lectina extracelular que se secreta junto a otras Rap(s) a través del sistema PrsDE; tiene la propiedad de interaccionar con el EPS en presencia de calcio, probablemente a través del dominio Ra2. Como resultado de esta interacción y la influencia de RapA2, la estructura del EPS se ve alterada. Estas observaciones abren interesantes interrogantes en cuanto a la función de proteínas extracelulares asociadas a la matriz de un biofilm.