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ROL DE TBLIPL, PUTATIVA LIPOATO LIGASA DE TRYPANOSOMA BRUCEI, EN LA MODIFICACION POSTRADUCCIONAL DE PROTEINAS

SCATTOLINI, Albertina | VACCHINA, Paola | UTTARO, Antonio D. | MANSILLA, Cecilia

INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO (IBR-CONICET, FBIOYF, UNR)

Introducción y Objetivos:
El ácido lipoico (AL) es un compuesto ampliamente distribuido en la naturaleza, requerido para el funcionamiento de complejos multienzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo y de un carbono. La lipoilación de proteínas ha sido exhaustivamente caracterizada en bacterias, donde existen vías de síntesis y de utilización de AL exógeno. La bacteria modelo Gram positiva Bacillus subtilis requiere de cuatro proteínas para la síntesis de AL: la octanoiltransferasa LipM transfiere la porción octanoílo desde ACP a GcvH; la lipoato sintasa, LipA, inserta los átomos de azufre y luego la amidotransferasa LipL transfiere el residuo lipoílo a los restantes complejos enzimáticos. B. subtilis también es capaz de utilizar AL exógeno, mediante la acción conjunta de la lipoato ligasa LplJ y LipL. En proteobacterias las vías son más sencillas, con una octanoiltransferasa (LipB) y una lipoato ligasa (LplA) que tienen como sustrato a todas las apoproteínas. En contraste, la información relativa a eucariotas es aún fragmentaria. Dado que la interferencia de la vía de síntesis de AL podría ser un potencial blanco quimioterapéutico contra parásitos como Trypanosoma cruzi o T. brucei, donde los tratamientos disponibles son poco efectivos y generalmente tóxicos, nos propusimos identificar las enzimas implicadas en la lipoilación de proteínas de tripanosomátidos.
Resultados:
Mediante análisis del genoma de T. brucei se identificó el locus Tb927.8.630, cuya secuencia de aminoácidos presenta homología con lipoato ligasas y amidotransferasas de bacterias y levaduras. Para caracterizar funcionalmente esta enzima (TbLipL), dicho gen se expresó bajo el control de un promotor inducible por xilosa en mutantes de B. subtilis deficientes en diferentes pasos de la vía de síntesis y captación de AL. No se observó complementación funcional de mutantes lipM, indicando que no posee actividad octanoiltransferasa, ni de la doble mutante lipM-lplJ, aún en presencia de AL, descartando actividad lipoato ligasa. Por el contrario, se observó la complementación funcional del crecimiento de una mutante lipL, lo que se correspondió con el restablecimiento del patrón de lipoilación proteica analizado mediante ensayos de Western Blot con anticuerpos anti-AL. La expresión de TbLlipL en una mutante gcvH no restauró su crecimiento en placas de medio mínimo ni el patrón de lipoilación proteica, sugiriendo que GcvH es sustrato de la reacción de transamidación. Por último, al expresar TbLipL en una mutante lipL-gcvH se restableció parcialmente el crecimiento de esta cepa en medio mínimo suplementado con AL. Esto indica que, al igual que la amidotransferasa de B. subtilis, esta enzima podría usar la subunidad E2 lipoilada de la oxoglutarato deshidrogenasa como sustrato para la transferencia a las restantes subunidades E2.
Conclusiones:
Estos resultados indican que TbLipL es una amidotransferasa, y que T. brucei presenta una vía de lipoilación endógena del tipo “lipoyl-relay”, como la descripta en B. subtilis y levaduras.