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ESTRATEGIAS PARA LA EXHIBICIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS SOBRE LA SUPERFICIE DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS USANDO COMO CARRIER EL DOMINIO CT DE SLPA DE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

DEPARTAMENTO QUÍMICA BIOLÓGICA FCEN-UBA 1; DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA FCEN-UBA IQUIBICEN CONICET 2

Introducción y Objetivos:
Las proteínas S-layer de L. acidophilus forman un rearreglo cristalino de muy alta densidad unido a la pared celular de manera no covalente. SlpA, proteína S-layer predominante de L. acidophilus presenta dos dominios bien definidos: el NT, de interacción con el ambiente celular externo; y el CT, responsable del anclado a la superficie bacteriana. Por otro lado las Bacterias Ácido Lácticas, por su status GRAS y porque muchas de ellas son especies con reconocidas características probióticas se han convertido en excelentes candidatos para ser usados como vehículos vivos de antígenos y proteínas bioactivas a nivel de mucosas con fines terapéuticos. Este trabajo tiene como objetivo principal evaluar la capacidad de anclado de la proteína SlpA de L. acidophilus para la presentación en superficie de proteínas heterólogas en BAL y su estabilidad y viabilidad celular frente a condiciones gastrointestinales.
Materiales y Métodos:
Para esto se ha producido de manera heteróloga el dominio CT de SlpA fusionado a GFP en Escherichia coli, construcción denominada GFP-CTSlpA. Se han evaluado distintas especies de Lactobacillus para ser decoradas con la proteína carrier. También se han estudiado distintas estrategias de crecimiento para optimizar el binding de GFP-CTSlpA: células decapadas con LiCl 5M, NaCl 5M y células precrecidas en NaCl 0.5 y 0.6 M. El ensayo de binding consiste en crecer las células hasta fase estacionaria, realizar el decapado de S-layer y ajustar la DO 600nm a 1. Alícuotas de 300 μl de cultivo bacteriano son incubadas con 10 μg de GFP-CT SlpA por 60 min. 37 ºC. Finalmente se cuantifica el binding con la proteína de fusión a través de microscopía de fluorescencia y técnicas de citometría de flujo. Hallado el mejor vehículo celular y la condición que garantice el mayor binding, se evaluó la estabilidad del mismo frente a condiciones gastrointestinales: estabilidad a pH ácido, sales biliares y pancreatina.
Resultados:
De las BAL estudiadas, el mejor vehículo celular resultó L. acidophilus previamente decapado con LiCl. Cuando este mismo microorganismo es precrecido en condiciones de estrés osmótico y además decapado con NaCl se logra una retención de la proteína recombinante del 50 % y 70 % respectivamente. En cuanto a la estabilidad del binding frente a condiciones gastrointestinales, se obtuvo una retención del 50% luego de la incubación a pH 3 y una retención superior del 60 % post incubación con sales biliares y pancreatina. En la viabilidad a condiciones de pH ácido (pH3) se ha visto una mayor tolerancia en células decoradas con la proteína GFP-CTSlpA (1x107 UFC/ml) respecto de células decapadas (1.5x 105 UFC/ml).
Conclusiones:
Estos resultados demuestran que L. acidophilus es un buen candidato para exponer en superficie proteínas o epitopes antigénicos a través del dominio CT de SlpA, demostrando además una estabilidad de la proteína expuesta cuando el microorganismo es sometido a condiciones de estrés propias del ambiente gastrointestinal.