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BÚSQUEDA DE DETERMINANTES DE RECONOCIMIENTO ENTRE HISTIDINA QUINASAS Y REGULADORES DE RESPUESTA HOMÓLOGOS DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS.

FERNANDEZ, Pilar 1 | RÉ, María Florencia1 | DÍAZ, Alejandra R.2 | DE MENDOZA, Diego1 | MANSILLA, Cecilia1

INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO (IBR-CONICET, FBIOYF, UNR) 1; DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA - UNS - BAHÍA BLANCA 2

Introducción y Objetivos:
Los sistemas de dos componentes (SDC) son vías de transducción de señales ampliamente distribuidos en bacterias. Están conformados por una histidina quinasa sensora (HQ) que cumple la función de percibir una señal externa y transmitirla al interior celular, y un regulador de respuesta (RR). La vía Des de Bacillus subtilis es un sistema de adaptación a bajas temperaturas, ampliamente estudiado en nuestro laboratorio, compuesta por la HQ DesK y el RR DesR. DesK percibe por medio sus segmentos transmembrana el descenso de la temperatura de crecimiento por debajo de los 25°C y se autofosforila. Posteriormente transfiere el fosfato a DesR y éste entonces se une al promotor Pdes, induciendo la transcripción del gen que codifica para una delta5-desaturasa. Hemos identificado en B. subtilis un SDC homólogo a DesK-DesR formado por la HQ YvfT y el RR YvfU. Este sistema regula la transcripción de dos genes, ubicados corriente arriba del mismo, que codifican para un putativo transportador ABC. Esta organización cromosomal se encuentra conservada en Firmicutes, incluyendo numerosas especies patógenas. La transcripción de estos genes también depende de temperatura y su región promotora está altamente conservada, conteniendo secuencias similares a las cajas de unión a DesR identificadas en Pdes. En estudios anteriores hemos determinado que las quinasas BA5598 de Bacillus anthracis y SA1313 de Saphylococcus aureus son capaces de reconocer a DesR in vivo, mientras que YvfT no lo reconoce. El objetivo de este trabajo consistió en probar in vitro la capacidad de autofosforilación de las HQs y de fosfotransferencia a su propio RR o cruzada con DesR. Además, nos planteamos identificar los aminoácidos involucrados en la interacción entre quinasas y reguladores.
Resultados:
Para este fin purificamos los dominios citoplasmáticos de las HQ y RR fusionados a colas de histidina, mediante cromatografía de afinidad. Mediante la reacción con ATP[32P] y separación en SDS-PAGE pudimos demostrar la autofosforilación de las HQ BA5598, SA1313 e YvfT y la posterior fosfotransferencia a los RR BA5597, SA1314 e YvfU respectivamente. Además, demostramos que las HQ que provienen de otras especies presentan fosforilación cruzada con DesR mientras que YvfT, que se encuentra en la misma especie, no lo fosforila. Mediante modelados moleculares generados a partir de las estructuras cristalográficas de DesKC y DesR realizamos una comparación de las interacciones entre HQ ortólogas y DesR, logrando identificar residuos aminoacídicos esenciales para esta interacción.
Conclusiones:
Los SDC constituyen el grupo de genes parálogos más grande en bacterias. Han evolucionado para evitar la comunicación indeseada entre ellos y, por el contrario, les permiten a los microorganismos diversificar las señales percibidas utilizando una vía de transducción altamente conservada. En este trabajo comenzamos a elucidar cuales serían los factores que determinan la especificidad en los SDC homólogos a DesK-DesR.