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EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE BIOCATALIZADORES TIPO BAEYERVILLIGER MONOOXIGENASA IN VIVO E IN VITRO

CECCOLI, Romina D. 1 | BIANCHI, Dario A.2 | RIAL, Daniela V.1

FACULTAD DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS, UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO - CONICET 1; INSTITUTO DE QUÍMICA ROSARIO (CONICET-UNR) - FACULTAD DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS, UNR 2

Introducción y Objetivos:
El uso de biocatalizadores para aplicaciones en síntesis química es un recurso cada vez más explotado dado que las enzimas permiten llevar a cabo reacciones de forma selectiva, eficiente y amigable desde el punto de vista medioambiental. Las Baeyer-Villiger monooxigenasas (BVMOs) son flavoenzimas que catalizan la oxidación de cetonas lineales o cíclicas para producir ésteres o lactonas, respectivamente, que constituyen moléculas de interés tanto para la academia como la industria 1. El objetivo de nuestro trabajo es caracterizar nuevas BVMOs a fin de ampliar el repertorio de biocatalizadores disponibles con potencial para su aplicación en síntesis química. Nuestro grupo ha clonado y expresado tres BVMOs tipo I divergentes de Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 en Escherichia coli. En este trabajo se presenta una evaluación detallada de la regio- y/o enantioselectividad de las tres enzimas tanto en los sistemas in vivo como in vitro.
Materiales y Métodos:
Mediante ensayos de biotransformación en células enteras recombinantes en condiciones de reposo, hemos evaluado la regio- y enantioselectividad de la reacción de cada BVMO frente a la cetona (±)-cis-biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona. Los productos fueron analizados por cromatografía gaseosa y asignados utilizando biotransformaciones de referencia. Además, hemos purificado a homogeneidad las tres flavoenzimas, identificado sus flavinas y determinado sus coeficientes de absortividad molar. La actividad de las enzimas puras fue evaluada en ensayos in vitro, en los que se estudió la reacción de biooxidación de la cetona bicíclica, acoplada a un sistema regenerante de NADPH, mediante cromatografía gaseosa.
Resultados:
In vivo, una de las BVMOs permitió obtener, por bioooxidación de la cetona en estudio, dos regioisómeros enantioméricamente puros. Las otras dos BVMOs catalizaron la oxidación regioselectiva y enantiodivergente del sustrato bicíclico en los ensayos de resolución cinética dando lugar preferentemente a las lactonas anormales con alto grado de pureza óptica. Las tres enzimas puras evaluadas contenían FAD asociado no covalentemente y presentaron coeficientes de absortividad molar similares a los de otras flavoproteínas de la misma familia. Los experimentos in vitro, confirmaron las regioselectividades observadas in vivo.
Conclusiones:
Estos nuevos biocatalizadores enriquecen así el alcance de las potenciales aplicaciones biotecnológicas. Referencia: 1. Ceccoli, R. D.; Bianchi, D. A.; Rial, D. V. Front. Microbiol. 2014, 5, 25. Financiamiento: CONICET y UNR, Argentina.