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CUANTIFICACIÓN POR MICROSCOPIA CONFOCAL DE EXPLORACIÓN LASER DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA PRODUCIDA POR NANOPARTÍCULAS DE PLATA SOBRE BIOFILM FÚNGICO

CÁT. MICROBIOLOGÍA, FAC. CS. EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES, UNIV. NACIONAL DE CÓRDOBA. 1; IMBIV-CONICET. CÁT. MICROBIOLOGÍA, FAC. CS. EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES, UNIV. NACIONAL DE CÓRDOBA 2; CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA, DPTO. DE BIOCIENCIAS, FACULTAD DE QUÍMICA, UDELAR 3; DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS. FCQ. UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA / UNITEFA - CONICET 4

Introducción y Objetivos:
La incidencia de la infecciones por Candida se ha incrementado en la última década, asociada muchas veces a la presencia de biofilms en implantes, prótesis y catéteres; agravado por la frecuente resistencia a los agentes quimioterápicos utilizados en la clínica. Se ha tratado de contrarrestar con dosis más altas de antifúngicos (ATFs) o con terapia combinada, con los riesgos de efectos adversos que esto implica. Por este motivo esta temática requiere la investigación y búsqueda incesante de nuevas drogas antifúngicas. Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que nanopartículas de plata (NP Ag) biosintetizadas a partir de Penicillium expansum poseen actividad antibiofilm sobre Candida tropicalis. El objetivo de este trabajo fue profundizar dicho estudio cuantificando mediante Microscopia Confocal de Exploración Laser (MCEL) distintos parámetros de la topografía y estructuras del biofilm tratado con estas NP solas y combinadas con Anfotericina B (AmB).
Materiales y Métodos:
Se utilizó AmB (50μg/ml), las NP Ag biosintetizadas (13,5nM) y su combinación, sobre biofilm maduro de a C. tropicalis NCPF 3111. La formación de biofilm y el correspondiente tratamiento antifúngico se realizó sobre discos de vidrio en microplacas de 12 pocillos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y las muestras se tiñeron con Calcofluor White (0,05%v/v) el cual tiñe de azul la pared celular y la matriz exopolisacárida del biofilm fúngico. Las imágenes resultantes se procesaron con el programa ImageJ, por el cual se generó la vista del plano XY y ortogonal, y la reconstrucción en tres dimensiones de las distintas condiciones. Además, mediante el software COMSTAT se obtuvieron los siguientes parámetros cuantitativos: biomasa, espesor, coeficiente de rugosidad y distancia de difusión de las condiciones de los compuestos solos y de la combinación NP Ag+AmB. El análisis estadístico se realizó con el programa Infostat mediante ANOVA seguido del test Tukey con nivel de significación p<0,05.
Resultados:
Los parámetros cuantificados mostraron los siguientes resultados: biomasa (μm3/ μm2) 22,42 y 1,44; espesor (μm) 23,08 y 1,50; coeficiente de rugosidad (Ra*) 0,05 y 1,76 y distancia de difusión (μm) 1,91 y 0,37, para las condiciones control no tratado y con NP Ag+AmB, respectivamente. Para biomasa y espesor se calculó una reducción del 94%, este resultado tiene concordancia con lo encontrado por otras metodologías. El coeficiente de rugosidad aumentó y la distancia de difusión presentó una marcada disminución, parámetros que demuestran las alteraciones en la estructura del biofilm.
Conclusiones:
Estos resultados corroboran la actividad anti-biofilm de las NP Ag en una cepa de C. tropicalis, mostrando alteraciones topográficas y estructurales. Por lo tanto, alientan a seguir estudiando en profundidad el mecanismo de acción de este compuesto como posible alternativa para el tratamiento de infecciones por cepas de Candida formadoras de biofilm.