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CONSTRUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN SISTEMA REPORTERO PARA ESTIMAR LA TRANSFERENCIA CONJUGATIVA DE RHIZOBIUM FAVELUKESII LPU83

LUCHETTI, Abril | CASTELLANI, Lucas | NILSSON, Juliet | PISTORIO, Mariano | TORRES TEJERIZO, Gonzalo

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, IBBM--CONICET, FAC. CS EXACTAS, UNLP

Introducción y Objetivos:
Los rizobios son bacterias que interaccionan simbióticamente con las raíces de plantas leguminosas. Durante esta interacción, estas bacterias son capaces de transformar el nitrógeno (N) del aire en amonio. Los cultivos agronómicos dependen de los niveles de N en los suelos, por lo que se suele aprovechar la capacidad fijadora de N de los rizobios al utilizarlos como inoculantes para mejorar el rendimiento de dichos cultivos. Sin embargo, poco sabemos de cómo la liberación masiva de estas bacterias afecta la biodiversidad de los suelos. La transferencia horizontal de genes es una de las mayores fuerzas que contribuye a la diversificación y adaptación bacteriana, siendo la transferencia conjugativa (TC) uno de los factores más importantes. pLPU83a, un plásmido de Rhizobium favelukesii LPU83, es capaz de transferirse por conjugación, evidenciando un mecanismo de regulación de su TC que depende del regulador transcripcional TraR, pero no de Acil-homoserin lactonas. Esto hace a pLPU83a un buen candidato para el estudio de nuevos mecanismos de regulación de la TC. El objetivo de este trabajo es la construcción de un sistema reportero que nos permita evaluar la expresión de genes involucrados en la TC mediante medidas de fluorescencia y correlacionar dichos valores con la TC.
Materiales y Métodos:
Las conjugaciones fueron realizadas empleando la técnica de Simon (1989). Se midió la fluorescencia de los cultivos de las cepas en diferentes etapas de crecimiento y se relacionó con la densidad óptica (DO) a 600 nm, las UFC y la frecuencia conjugativa.
Resultados:
Se construyó un vector para realizar fusiones transcripcionales, en el cual puede clonarse cualquier promotor río arriba de la proteína verde fluorescente (GFP). En dicho vector se clonó el promotor del gen traR Y se transfirió a las cepas de R. favelukesii LPU83 silvestre y mutante en el gen pLPU83a0146, el cual muestra un aumento en la frecuencia conjugativa. Mediante experimentos de transcriptómica, se observó que en dicho mutante la expresión de distintos genes involucrados en la TC se encontraba aumentada, siendo el gen del regulador traR el de mayor aumento. La relación entre fluorescencia y DO, en bacterias en fase exponencial, fue mayor en la cepa mutante que en la cepa silvestre, indicando una mayor expresión del gen traR. En condiciones de cultivo tardías, para la cepa salvaje, no se observó un incremento en la relación fluorescencia/densidad óptica, lo cual se corresponde con resultados reportados en nuestro grupo (Castellani et al., 2019).
Conclusiones:
Hemos observado que los datos obtenidos por transcriptómica se corresponden con aquellos obtenidos por una metodología más simple. Esto nos permitirá evaluar la expresión de otros genes involucrados en la TC y poder medir así la frecuencia conjugativa sin tener que recurrir a la técnica clásica de conjugación de plaqueos con antibióticos y recuento de bacterias viables.