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OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES EN PROTEASAS ROMBOIDES EN LA HALOARQUEA HALOFERAX VOLCANII

GIMENEZ, Maria Ines | LATORRE, Lucas Leonel | PAGGI, Roberto Alejandro | DE CASTRO, Rosana Esther

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS, IIB CONICET UNMDP, FCEYN

Introducción y Objetivos:
La mayoría de las proteasas poseen sus sitios activos expuestos al medio soluble (citoplasma extracelular o periplasma). Existe un grupo particular, las proteasas intramembrana, cuyos sitios activos están inmersos en la bicapa lipídica que rodea a las células y son capaces de llevar a cabo reacciones de hidrólisis en el entorno hidrofóbico de la membrana celular. Dentro de este grupo se encuentran las proteasas Romboides, proteínas conservadas en los tres Dominios de la vida y que se encuentran asociadas al desarrollo de patologías de importancia en humanos. En el genoma de la arquea halófila Haloferax volcanii existen dos genes homólogos de romboides, rhoI (HVO1474) y rhoII (HVO0727). En estudios previos construimos una mutante nula para rhoII (MIG1). Esta mutante presenta menor movilidad en placas de agar, una menor recuperación a la irradiación con luz UV y defectos en la glicosilación de la proteína constituyente de la pared celular (capa S). La mayoría de estos fenotipos si bien reproducibles son leves, sugiriendo que RhoI podría suplir (al menos parciamente) la función de RhoII. En este trabajo se presenta la construcción y caracterización parcial de una mutante condicional en rhoI y de una doble mutante (nula para rhoII y condicional para rhoI).
Materiales y Métodos:
Las mutantes condicionales fueron obtenidas mediante la inserción de un promotor inducible por triptófano (ptnA) inmediatamente río arriba de la secuencia correspondiente al gen rhoI mediante doble recombinación homóloga (técnica de pop-in/pop-out).
Resultados:
La correcta inserción de ptnA en el cromosoma fue verificada por PCR. La mutante simple presentó mayor tolerancia al estrés salino (exceso y defecto de NaCl) con respecto a la cepa parental. El análisis de la movilidad en placas de agar blando evidenció que la expresión de rhoI a partir del plásmido pTA963 en la cepa MIG1 es capaz de revertir dicho fenotipo. Por otra parte, la disminución en el nivel de rhoI afectó levemente la movilidad en la mutante condicional simple mientras que la mutante doble mostró un fenotipo aún más marcado que MIG1.
Conclusiones:
Los resultados obtenidos aportan información acerca de los sistemas proteolíticos intramembrana de arqueas y sugieren el solapamiento funcional entre los homólogos de proteasas romboides en la regulación de la movilidad de H. volcanii.