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EXPRESIÓN DE UNA LACASA DE PHEBIA BREVISPORA EN KLUYVEROMYCES LACTIS

MOLINA, Melisa Antonella 1 | MILDE, Laura2 | SGROPPO, Sonia Cecilia3 | ZAPATA, Pedro Darío4 | FONSECA, Maria Isabel5

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR - INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MISIONES "DRA. MARÍA EBE RECA" 1; LABORATORIO 204. MÓDULO FARMACIA Y BIOQUÍMICA. UNAM 2; IQUIBA- NEA 3; LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR - INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MISIONES "DRA. MARÍA EBE RECA" 4; LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR. INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MISIONES “DRA. MARÍA EBE RECA” 5

Introducción y Objetivos:
Phlebia brevispora BAFC 633 es un hongo de pudrición blanca que produce una lacasa principal de 60 kDa y una de 75 kDa, que han sido purificadas y caracterizadas. Ésta enzima puede ser utilizada en procesos industriales, para lo que es necesario producirla en grandes cantidades y una manera de lograrlo es expresándola en la levadura GRAS Kluyveromyces lactis, que es de elevado interés biotecnológico debido a que tiene el potencial de expresar altos niveles y a gran escala proteínas recombinantes mediante rápido crecimiento de alta densidad celular y sin presentar background de expresión celular durante los pasos de clonación en Escherichia coli.
Materiales y Métodos:
El presente trabajo tuvo como objetivo obtener lacasa recombinante a partir del ADNc aislado del hongo de pudrición blanca P. brevispora BAFC 633. Para ello, se realizó una amplificación por PCR utilizando como templado el gen previamente subclonado por el grupo y luego se digirió con las enzimas de restricción NotI y XhoI, al igual que el vector de expresión utilizado, pKLAC2. Estos productos fueron ligados y utilizados para realizar la transformación de las bacterias Escherichia coli utilizando ampicilina para la selección. Luego se llevó a cabo la extracción del ADN plasmidico mediante un procedimiento de lisis alcalina. La calidad de estos plásmidos se analizaron mediante electroforesis en geles horizontales de agarosa. Seguidamente se procedió a la linealización con la enzima Sac II, de los plásmidos que resultaron contener el gen de interés y se prosiguió a la clonación dentro de la levadura K. lactis. Los recombinantes se seleccionaron mediante la aparición de un halo verde en medio YCB suplementado con ABTS. En todas las etapas se verificó la identidad de la secuencia mediante secuenciación y herramientas bioinformáticas.
Resultados:
De esta manera, los recombinantes que mostraron halos más intensos y grandes se seleccionaron para continuar posteriomente con el estudio exhaustivo en medio líquido. Finalmente, se verificó que el marco de lectura de la proteína de interés es correcto con 1500 pb.
Conclusiones:
Estos resultados confirman que K. lactis es un hospedero apropiado para producir lacasa, sentando del mismo modo las bases para futuras investigaciones de la proteína, como así también para su aplicación en diferentes procesos.