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IDENTIFICACIÓN MEDIANTE RNA-SEQ DE SRNAS NO CODIFICANTES EN DISTINTAS CONDICIONES DE AIREACIÓN Y ESTRÉS OXIDATIVO EN PSEUDOMONAS EXTREMAUSTRALIS: ANÁLISIS DEL SRNA40

SOLAR VENERO, Esmeralda Clara 1 | TRIBELLI, Paula2 | LOPEZ, Nancy2

IQUIBICEN 1; DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA FCEN-UBA IQUIBICEN CONICET 2

Introducción y Objetivos:
Los pequeños RNAs no codificantes (sRNA) desempeñan un papel clave como reguladores post-transcripcionales mediando en la estabilidad y eficiencia de traducción de los mRNA. La regulación de la expresión mediante sRNA en Pseudomonas es un área de investigación activa y de relevancia en especies ambientales y patógenas. P. extremaustralis es un microorganismo extremófilo por lo que su estudio puede aportar información sobre mecanismos de adaptabilidad a condiciones de estrés. Debido al impacto que tienen los agentes oxidantes, aún cuando la disponibilidad de oxígeno es baja, en este trabajo nos proponemos analizar la presencia y funcionalidad de sRNA regulatorios relacionados con microaerobiosis y estrés oxidativo en P. extremaustralis.
Materiales y Métodos:
Se analizaron diversos sRNA con posible actividad regulatoria previamente identificados por experimentos de RNAseq en aerobiosis (A), microaerobiosis (M) y microaerobiosis expuestas a H2O2 (m-OS). Se comprobó el tamaño y perfil de transcripción de 8 sRNAs con expresión diferencial por Northern blot. Se seleccionó al sRNA40, cuya secuencia se encuentra conservada en otras especies de Pseudomonas, pero cuya función no ha sido descripta, para realizar experimentos de sobre-expresión seguidos de RNAseq. Su secuencia se clonó en un vector de expresión bajo el control de un promotor inducible (cepa P. extremaustralis/pBAD18-sRNA40). La expresión del sRNA a distintos tiempos de inducción se verificó por Northern blot, seleccionándose 10 min como tiempo experimental para el análisis transcriptómico de P. extremaustralis conteniendo pBAD18-sRNA40 y pBAD18 vacío. Se utilizó el programa Rockhopper para determinar los genes con expresión diferencial. Además, se empleó el programa IntaRNA para realizar la predicción del interactoma del sRNA40 y modelar la interacción del sRNA con los genes que exhibieron expresión diferencial luego de la sobre-expresión.
Resultados:
La predicción in silico del interactoma del sRNA40 permitió identificar 100 posibles blancos de regulación. En relación a esto se pudo observar que la mayor parte de las interacciones involucran la región correspondiente a los primeros 120 bp del sRNA, siendo las bases más relevantes aquellas cercanas a la posición 90. El análisis del perfil transcriptómico mostró expresión diferencial de 19 genes (P<0.05, Q<0.05), de los cuales 14 se encontraron sobre-expresados y 5 reprimidos. Cabe destacar que 8 de estos transcriptos corresponden a componentes de los sistemas de secreción II y III (T2SS y T3SS). Entre ellos, xcpU, xcpX y xcpZ, pertenecientes al sistema general de secreción. El modelado reveló que la interacción del sRNA40 con los genes obtenidos se ve energéticamente favorecida.
Conclusiones:
En conjunto, los resultados obtenidos permitieron identificar sRNAs que mostraron expresión diferencial en microaerobiosis y estrés oxidativo cuya función todavía debe ser dilucidada. Se observó que el sRNA40 actúa en respuesta a estrés oxidativo, probablemente afectando la regulación de los mecanismos de secreción.