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PCR-L-CYS: UNA PCR-MULTIPLEX INNOVADORA PARA DETECTAR LA PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO EN CAMPYLOBACTER FETUS Y CONTRIBUIR CON SU IDENTIFICACIÓN

IABIMO INTA-CONICET; CICVYA, INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 1; DEP. DE PRODUCCIÓN ANIMAL, LAB. DE BACTERIOLOGÍA, INTA EEA BALCARCE 2; ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGROPECUARIA RAFAELA, INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA (INTA) 3

Introducción y Objetivos:
Campylobacter fetus es un patógeno que produce trastornos intestinales e infecciones sistémicas severas en humanos. En animales, está asociado a infertilidad y abortos en vacunos, enfermedad conocida como Campilobacteriosis Genital Bovina (CGB). Las diferencias fenotípicas entre la subespecie Campylobacter fetus fetus (Cff) y Campylobacter fetus venerealis (Cfv) permiten el diagnóstico diferencial de la CGB. La producción de sulfuro de hidrógeno es un rasgo exclusivo de Cff y Campylobacter fetus venerealis biovar intermedius (Cfvi). Dicho gas es producido a partir de L-cisteína y puede ser analizado bioquímicamente. La presencia de una deleción en un transportador de L-cisteína interrumpe la producción de este gas en las cepas de Cfv, como se describió anteriormente. En el presente trabajo, reportamos una nueva PCR-multiplex dirigida al operón que codifica al transportador de L-cisteína con el objetivo de contribuir con una herramienta molecular para la diferenciación de las subespecies de Campylobacter fetus.
Materiales y Métodos:
Se diseñaron oligonucleótidos para la PCR-multiplex utilizando el programa Unipro UGENE 1.31 (http://ugene.net/), con el fin de evaluar la presencia o ausencia de la deleción y producir un patrón diferencial en el producto de amplificación. Se estudiaron 34 aislamientos obtenidos a partir de muestras clínicas bovinas. Todos los aislamientos se cultivaron en placas de agar Skirrow bajo condiciones de microaerofilia durante 72 h a 37°C y fue evaluada la producción de sulfuro de hidrógeno bioquímicamente. Posteriormente se realizó un estudio in silico empleando el programa PrimerMap (https://www.bioinformatics.org/sms2/primer_map.html) para el análisis de 35 secuencias de genomas completos de acceso público (NCBI) y 3 secuencias de cepas locales obtenidas por NGS en nuestro laboratorio, de esta manera se incrementó la diversidad de cepas estudiadas.
Resultados:
Se obtuvo un producto de 714 pb para las subespecies Cff y Cfvi, mientras que para Cfv se obtuvo un producto de 310 pb, correspondiendo este último caso a la deleción parcial del operón. Se obtuvo una correlación perfecta entre la prueba bioquímica y la prueba desarrollada (kappa=1). Asimismo, se obtuvo la misma correlación cuando se analizó in silico la performance de la PCR-multiplex.
Conclusiones:
En este trabajo demostramos que la PCR-L-Cys tiene la potencialidad de reemplazar a la prueba bioquímica de producción de sulfuro de hidrógeno actualmente empleada, constituyendo una herramienta valiosa para el diagnóstico diferencial de Campylobacter fetus.