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DESARROLLO DE UN SISTEMA POINT OF CARE PARA LA DETECCIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS

LIGBCM - UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES 1; LEBYM - LABORATORIOS DE ESTUDIOS BIOQUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS 2

Introducción y Objetivos:
Actualmente existe un gran desarrollo de sistemas de detección molecular rápidos y de bajo costo denominados (POC). Una etapa importante en el proceso de detección de ácidos nucleicos es la amplificación de los mismos. Las metodologías más utilizadas estan asociadas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, existen tecnologías de amplificación isotérmicas más eficientes y económicos. En nuestro laboratorio desarrollamos una tecnología de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos acoplada a sondas fluorescentes, que le confieren alta especificidad y sensibilidad al sistema. Esta tecnología fue acoplada a un dispositivo POC capaz de leer y almacenar los resultados. El objetivo del presente trabajo fue utilizar esta plataforma para el desarrollo de un sistema POC de diagnóstico molecular de Chlamydia trachomatis y evaluar su desempeño.
Materiales y Métodos:
A partir del análisis bioinformático de genomas de, se diseñaron oligonucleótidos y sondas específicas de los genotipos más representativos de Argentina (D, E, F, G, H, I, J, K). Se analizaron los parámetros de reacción para estudiar la eficiencia del sistema. Luego de obtener las condiciones óptimas, se analizó la sensibilidad y especificidad del sistema utilizando muestras con ADN sintético de Ct. Los resultados fueron analizados utilizando un equipo de real time PCR y electroforesis en gel de agarosa. Por otro lado, las muestras fueron evaluadas en un dispositivo POC, construido, basado en la detección de una reacción colorimétrica acoplada a la amplificación del ADN. Por último se analizaron muestras de pacientes, previamente evaluadas por real time PCR y microscopía.
Resultados:
Se optimizaron todos los componentes de reacción analizando parámetros cinéticos (Ct y amplitud de la señal) en un equipo de real time PCR. Una vez optimizada la reacción, se evaluó la sensibilidad del sistema utilizando una curva patrón de ADN sintético. Se obtuvo una sensibilidad del orden 10-100 moléculas. Para evaluar la especificidad del sistema se utilizó ADN genómico de bacterias relacionadas. Se obtuvo 100 % de especificidad respecto a las muestras ensayadas. Por último, se evaluaron muestras clínicas previamente analizadas mediante real time PCR y microscopía. Se obtuvo 100 % de sensibilidad y 100% de especificidad respecto a la metodología de referencia.
Conclusiones:
Teniendo en cuenta las ventajas que presentan las metodologías de amplificación isotérmica, se desarrolló una nueva metodología que incorpora sondas fluorescentes que confieren mayor sensibilidad y especificidad al sistema. Esta tecnología fue utilizada para el desarrollo de un sistema de diagnóstico molecular para Ct. La validación del sistema demostró parámetros de sensibilidad y especificidad comparables a la metodología de referencia. Los resultados fueron obtenidos en un rango de 30-45 minutos. Actualmente se continúa trabajando en el análisis de un mayor número de muestras, para aumentar la confiabilidad y robustez del sistema.