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CARACTERIZACION DE UN SISTEMA TIPO I DE SECRECION DE PROTEINA RTX EN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM

RUSSO, Daniela 1 | DOWNIE, J.Allan2 | ZORREGUIETA, Angeles1

IIBBA-CONICET Y FUNDACION INSTITUTO LELOIR 1; JOHN INNES CENTER 2

Introducción y Objetivos:
Identificamos el sistema de secreción de proteínas tipo I (SST1) en el plásmido simbiótico pRL1JI de la cepa 248 de Rhizobium leguminosarum RssDM (RTX-secretion system). El locus plasmídico está compuesto por un transportador ABC (ATP Binding Cassette) y su adaptador MFP (Membrane Fusion Protein), rssD y rssM respectivamente. Rio abajo y en el mismo sentido, dos ORFs codifican proteínas de la familia RTX (Repeated in ToXin), RTX-1 y RTX-2. Las proteínas RTX están ampliamente distribuidas y comprenden diversas funciones como la formación de poros en membranas lipídicas, proteasas, lipasas o bacteriocinas. Nos proponemos estudiar el rol del sistema secretor RssDM y las proteínas RTX en el ciclo de vida de la bacteria.
Materiales y Métodos:
En este trabajo se emplearon cepas mutantes derivadas de R. leguminosarum bv. viciae 248 (Rlv 248) afectadas en los genes rssD, rtx-1, rtx-2 y rtx-1 rtx-2. Se transfirió el cósmido pIJ1552 que contiene una región de 30kb proveniente del pSym que comprende el locus rssD rssM rtx-1 rtx-2. Este cósmido fue transferido la cepa Rlv 248 curada del pSym y mutagenizado en el gen rssD. Se analizó el secretoma de cepas de Rlv 248 mediante LC-MS y LFQ empleando tres réplicas de las muestras proteicas. Se evaluó la capacidad inhibitoria del crecimiento de los rizobios en placa en agar blando co-polimerizado con la cepa indicadora (sensible) e inoculando la cepa a testear (actividad bacteriocina). Los estudios de la capacidad de nodulación y competencia de los rizobios se realizaron inoculando plántulas de Pisum sativum y Vicia fabra.
Resultados:
El análisis comparativo (LFQ) de los secretomas de las cepas derivadas de Rlv 248 WT y la mutante rssD sugiere que secreción de la proteína Rtx-1, codificada en el pRL1JI, depende del sistema SST1 RssDM mientras que las proteínas Rtx-2, RzbA y NodO son independientes. En cuanto al análisis del secretoma de la cepa curada del pSym y portadora del cósmido pIJ1552, se verificó que confiere la capacidad de secretar Rtx-1, Rtx-2 y péptidos derivados de Rzb248 mientras que la interrupción de rssD eliminó la capacidad de exportar Rtx-1. Los resultados del estudio de la actividad bacteriocina sugiere la presencia de al menos dos actividades inhibitorias del crecimiento de rizobios en Rlv 248. Una potente actividad bacteriocina presente en la cepa curada del pSym fue capaz de inhibir el crecimiento de la cepa silvestre. Esta bacteriocina no estaría codificada en el pRL1JI sino que asociada al cromosoma. La presencia del pSym reprimió fuertemente esta actividad mientras que el cósmido lo hizo en forma parcial, lo que sugiere que contiene un modulador de su actividad. La segunda actividad bacteriocina inhibió el crecimiento de rizobios pertenecientes a Mesorhizobium spp y requirió del sistema RssDM funcional, sin embargo, no estaría asociada a las proteínas RTX-1 y RTX-2. Finalmente, los ensayos realizados en plántulas de arveja no evidenciaron diferencias significativas entre la cepa rssD y la WT en la capacidad de nodulación. Sin embargo, la competencia del rizobio se vio reducida significativamente en la cepa mutante rssD al ser co-inoculada con la cepa silvestre.
Conclusiones:
El sistema tipo I RssDM codificado en el pRL1JI de R. l. viciae 248 es responsable de la secreción de la proteína RTX-1 mientras que RTX-2, Rzb 248 y NodO son independientes. La actividad bacteriocina asociada al sistema secretor RssD fue capaz de inhibir el crecimiento de rizobios emparentados y no depende de RTX-1 ni RTX-2. Los ensayos en plantas sugieren que el sistema RssDM no sería esencial en la nodulación aunque tendría participación en el desempeño del rizobio durante la competencia por colonizarla