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OPTIMIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE EDICIÓN GÉNICA CRISPR/CAS9 EN ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICA O157:H7

RIVIERE, Nahuel | MARQUES DA SILVA, Wanderson | CATALDI, Angel | LARZABAL, Mariano

IABIMO INTA-CONICET; CICVYA, INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

Introducción y Objetivos:
La baja eficiencia en la obtención de mutantes para las cepas Escherichia coli patógenas generó la implementación del sistema CRISPR/Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 utiliza un ARN guía (ARNg) el cual hibrida de manera complementaria con la doble hebra de ADN (dsADN) blanco. La asociación ARNg-dsADN es reconocida por la endonucleasa Cas9 que produce un corte en dsADN del gen de interés. El aporte de un nuevo ADN donor (ADNd) combinado con el sistema de recombinación homóloga lambda Red permite incrementar considerablemente la eficiencia de mutagénesis. Se estableció como objetivo optimizar la metodología de edición génica CRISPR/Cas9 en Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7.
Materiales y Métodos:
Se seleccionó el gen no esencial mipA como blanco de mutación de una cepa Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) O157:H7. A partir de la secuencia de mipA se identificó la región PAM (protospacer adjacent motif) de mayor eficiencia de corte mediante el software online CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no). Se diseñó y clonó la secuencia del ADN guía (codifica para el ARNg) para dicha región PAM en el vector pCRISPR-SacB. Luego, una cepa EHEC O157:H7 fue transformada con el vector pCRISPR-SacB-ADNg. Posteriormente, la cepa fue transformada con el vector pCasRed que codifica tanto para la endonucleasa Cas9, necesaria para el corte de la doble hebra de ADN, como para la maquinaria de recombinación homóloga lambda Red compuesta por los genes exo, beta y gamma. Durante la transfomación también fue incorporado el ADNd que posee un codón stop prematuro y una deleción de 30 nucleótidos en relación al gen blanco. La recombinación del ADNd en el gen blanco generó una bacteria EHEC O157:H7 deficiente en la expresión del gen mipA. En presencia de sacarosa la bacteria puede eliminar al vector pCRISPRSacB- DNAg. Esto nos permitiría volver a diseñar un nuevo ADNg contra otro gen de interés para la obtención de múltiples mutantes.
Resultados:
Para la optimización de la metodología de CRISPR/Cas9 se evaluó la eficiencia de obtención de mutantes de la cepa EHEC O157:H7. Se demostró que la concentración óptima de plásmido pCRISPR-SacBDNAg para la transformación de la cepa EHEC O157:H7 fue de 100 ng totales. Por otro lado, fue necesaria una concentración de 25 mM de ADNd para la obtención de un mayor número de bacterias mutantes. También se pudo observar un mayor número de bacterias mutantes al ser recuperadas a 30°C durante 3 hs luego de ser transformadas. Estas condiciones permitieron obtener la máxima eficiencia de mutagénesis en EHEC O157:H7.
Conclusiones:
La optimización de la técnica de CRISPR/Cas9 permitió obtener cepas mutantes EHEC O157:H7 del gen no esencial mipA. Los resultados demostraron que CRISPR/Cas9 es una técnica, versátil, reproducible y altamente eficiente para la obtención de mutantes en EHEC O157:H7.