REY, María de Los Ángeles 1 | CAP, Mariana1 | VAUDAGNA, Sergio2 | MOZGOVOJ, Marina2
INSTITUTO TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS, CENTRO DE INVESTIGACIÓN DE AGROINDUSTRIA, INTA 1; INSTITUTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS, CIA, INTA. CONICET 2
Introducción y Objetivos:
El PMA (propidium monoazide) es un colorante que se intercala en el ADN de bacterias muertas con su membrana plasmática comprometida e inhibe su amplificación por PCR. La membrana bacteriana es impermeable al colorante por lo que sólo puede penetrar células cuyas membranas se encuentren afectadas. Una vez en el interior de la célula, el PMA se une al ADN irreversiblemente intercalándose entre las bases gracias a la fotoactivación del colorante con luz azul LED. El complejo PMA-ADN así formado inhibe la acción de la polimerasa. De esta forma, la señal obtenida por qPCR solo es atribuible a células viables remanentes post procesamiento. El objetivo del presente trabajo fue poner a punto la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de STEC en hamburguesas de carne vacuna.
Materiales y Métodos:
Para ello, se determinó la concentración mínima de PMA necesaria para inhibir la señal de bacterias muertas, la posible influencia del PMA en la amplificación de distintas concentraciones de bacterias vivas y, la capacidad de discriminar diferentes concentraciones de bacterias vivas en presencia de una alta concentración de bacterias muertas, tanto en cultivo como en hamburguesa. La cepa seleccionada para los ensayos fue STEC O157:H7 (EDL 933). El PMA se agregó junto con el PMA enhancer y se sometió a un proceso de fotoactivación durante 15 min. Luego se realizó la extracción de ADN y se amplificó un fragmento del gen stx2 por PCR en tiempo real.
Resultados:
La concentración mínima de PMA necesaria para inhibir la señal de 5 log UFC/ml de bacterias muertas fue de 100 μM. La ausencia de influencia del PMA sobre la amplificación de distintas concentraciones de células viables se demostró comparando los valores de Ct obtenidos entre un grupo de muestras con concentraciones crecientes de bacterias vivas (3 a 6 log UFC/ml) tratado con PMA y otro grupo igual de muestras sin el colorante. Al no observarse diferencias significativas entre esos grupos se confirmó la ausencia de influencia. La capacidad de discriminar entre bacterias vivas y muertas se evaluó preparando un grupo de 9 muestras conteniendo 5 log UFC/ml de bacterias muertas combinadas con concentraciones crecientes de células vivas, desde 1 hasta 7 log UFC/ml, tanto en cultivo como en hamburguesa. Los resultados mostraron una disminución del Ct consistente con el aumento de la concentración de células vivas. Esto evidencia la capacidad del PMA para discriminar células viables de no viables, tanto en cultivo como en hamburguesa.
Conclusiones:
La técnica de PMA-qPCR resulta una alternativa novedosa y con gran potencial para detectar viabilidad de STEC en hamburguesas.
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Revista QuímicaViva Número 3, año 18, Diciembre 2019 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |
