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ANÁLISIS DE LOS MECANISMOS MOLECULARES EN LOS QUE PARTICIPA EL REGULADOR DEL SISTEMA DE DOS COMPONENTES ACTJ/ACTK DE ENSIFER MELILOTI UTILIZANDO HERRAMIENTAS PROTEÓMICAS

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, IBBM--CONICET, FAC. CS EXACTAS, UNLP

Introducción y Objetivos:
El estrés ácido presente en los suelos cultivables es uno de los principales factores que afectan el normal establecimiento y desarrollo de la simbiosis entre E. meliloti y alfalfa actuando en detrimento de una correcta nutrición nitrogenada de la planta. Superar dicho factor para la obtención de una simbiosis exitosa requiere del conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la tolerancia a la acidez, especialmente en el rizobio que es altamente sensible al estrés ácido. Nuestro grupo de trabajo ha detectado que el regulador transcripcional ActJ y la histidina quinasa ActK están vinculados con la tolerancia a la acidez y constituyen un sistema altamente conservado en E. meliloti y en otras rizobacterias. El objetivo de este trabajo consistió en hallar los marcadores moleculares asociados al rol de ActJ.
Materiales y Métodos:
Se caracterizaron y compararon los proteomas de E. meliloti 2011 salvaje y actJˆ- cultivadas en condiciones de pH ácido u óptimo. Se obtuvieron las proteínas citoplasmáticas y una fracción enriquecida de proteínas de membrana de cultivos rizobianos (pH 7,0 o 5,6) que se hallaban en fase de crecimiento exponencial. La identificación y cuantificación diferencial de proteínas fue realizada utilizando un espectrómetro de masa con analizador orbitrap acoplado a un nano-HPLC (LC/MS-MS). Se utilizó un valor de p <= 0,05 de un análisis por t-student para determinar si la expresión de una proteína se encontraba alterada. Para validar la posible participación de los marcadores diferenciales en la tolerancia al estrés ácido, mutantes en varios de los marcadores fueron evaluados en su capacidad de crecer en condiciones ácidas y neutras y la inducción de otros marcadores se analizó mediante fusiones transcripcionales.
Resultados:
El análisis se centró en: I) proteínas de clase I (PI), aumentadas o disminuidas en actJˆ- con respecto a la cepa salvaje; y II) proteínas de clase II (PII) presentes o ausentes en actJˆ-. Del total de proteínas analizadas, se identificaron 68 PI y 32 PII en la condición óptima y 51 PI y 12 PII en la condición ácida. El análisis global de los resultados permitió evidenciar que mientras en la condición neutra las funciones metabólicas se encuentran fuertemente representadas, a pH ácido se destaca la presencia de proteínas relacionadas con biogénesis de la membrana; metabolismo y transporte de carbohidratos, aminoácidos e iones y traducción de señales. Se encontró además que en ambas condiciones NrtA y DegP1 se hallaban diferencialmente expresadas en actJˆ- y que ActJ podría inducir la expresión de emrA a pH ácido y reprimirla a pH neutro.
Conclusiones:
Este estudio ha demostrado que la aplicación de una aproximación proteómica provee no solo un conjunto de marcadores de expresión diferencial, sino la posibilidad de identificar entre ellos ciertos marcadores cuya alteración conduce a una clara disfunción fenotípica asociada al estrés en estudio y ha permitido avanzar en la construcción de una imagen de los procesos celulares en los que ActJ participa