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IDENTIFICACION DE MUTACIONES PUNTUALES OCURRIDAS LUEGO DEL PROCESO DE ATENUACIÓN DE UNA CEPA DE INTERÉS PECUARIO DE LEPTOSPIRA INTERROGANS

NAGEL, Ariel 1 | AMADIO, Ariel Fernando2 | CAIMI, Karina

NSTITUTO DE AGROBIOTECNOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (IABIMO). INTA-CONICET. 1; ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGROPECUARIA RAFAELA, INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA (INTA) 2

Introducción y Objetivos:
Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis, una zoonosis distribuida mundialmente debido a que se contrae a través del agua contaminada con orina de animales infectados. En Argentina, el serogrupo más frecuente en bovinos es Pomona produciendo una infección severa que puede causar mortalidad en terneros. Previamente, nuestro grupo caracterizó mediante marcadores moleculares una cepa perteneciente a este serogrupo denominada AKRFB que forma parte de una formulación vacunal para bovinos y porcinos y de la cual se obtuvo el genoma completo (Varni et al, 2016). Estos resultados son de suma importancia epidemiológica, pero no permiten explicar los atributos patogénicos y de virulencia de este clon. El objetivo de este trabajo fue entonces, estudiar e identificar las bases moleculares de la cepa AKRFB mediante un análisis genómico comparativo que puedan afectar a la bacteria.
Materiales y Métodos:
Para llevar a cabo este estudio, se logró la atenuación de la cepa AKRFB Pasaje 1 (P1) mediante subcultivos en medio líquido obteniéndose su contraparte atenuada en el Pasaje 19 (P19). La atenuación se confirmó inoculando hámsters que es el modelo de enfermedad aguda (Nagel et al, 2019). Posteriormente, se extrajo ADN del cultivo de la variante P19 mediante un método casero. Se construyeron las bibliotecas genómicas utilizando el kit Nextera XT con extremos pareados. La secuenciación se realizó en el equipo Illumina MiSeq. Luego de filtrar las lecturas crudas se analizaron las características generales y se visualizaron cambios estructurales mediante GenoPlotR comparando contra P1 y un genoma de referencia para L. interrogans (serovar Lai cepa 56601). Por otro lado, se evaluaron polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) entre P1 y P19 con el software BreSeq seleccionando solamente aquellas que produjeron cambios no sinónimos en regiones codificantes.
Resultados:
Las características generales que presentó el genoma de P19 fueron: tamaño del genoma de 4.767.933 pb, porcentaje de GC de 35%, 3816 secuencias codificantes (CDS), 34 ARNs de transferencia y 3851 genes. A nivel estructural no se produjeron grandes reordenamientos entre P1 y P19, sólo se identificó una región ausente en la cepa de referencia que codifica para el antígeno O que se encuentra presente en P1 y P19. Mediante el análisis de SNPs se obtuvieron 91 mutaciones totales que fueron filtradas quedándonos sólo las que produjeron un cambio de aminoácido no sinónimo en regiones codificantes. Esto dió una lista final de 10 SNPs (4 caracterizados y 6 no caracterizados) ubicados en genes que codifican para proteínas directamente implicadas en la virulencia de Leptospira como lolA, katE, ompL1 y ligB. produce cambios puntuales en su genoma afectando diferentes funciones relacionadas con la virulencia. Adicionalmente, se presentan genes hasta el momento no caracterizados que pueden ser de importancia en la virulencia de Leptospira spp.