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ESTUDIO DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS INTRACELULARES DE APIOTRICHUM LOUBIERI M12 EN PRESENCIA DE CU(II)

BONILLA, José Oscar 1 | CALLEGARI, Eduardo Alberto2 | PAEZ, María Daniela2 | GIL, Raúl Andrés1 | VILLEGAS, Liliana Beatriz1

INSTITUTO DE QUÍMICA DE SAN LUIS (INQUISAL), CONICET. FQBYF, UNSL. 1; DIVISION OF BASIC BIOMEDICAL SCIENCES, SANFORD SCHOOL OF MEDICINE. UNIVERSITY OF SOUTH DAKOTA. 2

Introducción y Objetivos:
Apiotrichum loubieri M12, un microorganismo resistente a Cu(II), fue aislado a partir de sedimentos de un ambiente afectado por Drenaje Ácido de Mina en la provincia de San Luis. En estudios previos, este microorganismo fue capaz de remover alrededor del 35% de Cu(II) cuando creció en medio líquido con 40 μg mL-1 Cu(II) después de 48h de incubación. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas intracelulares de A. loubieri M12 en presencia y en ausencia de Cu(II), con el fin de entender los mecanismos homeostáticos de resistencia empleados por este microorganismo.
Materiales y Métodos:
A. loubieri M12 se cultivó en medio EG* (g L-1: glucosa 10,0; extracto de levadura 1,0; K2HPO4 0,5; KH2PO4 0,5), suplementado o no con 40 μg mL-1 Cu(II), durante 48h a 30°C y 200rpm. Las células se recuperaron por centrifugaron a 4.000 xg durante 20min a 4°C (Centrífuga U-320R). Los pellets celulares se lavaron dos veces con PBS (mM: NaCl 124; NaH2PO4 10; KH2PO4 3) y se conservaron durante 24h a -20°C. Luego, se procedió a la ruptura mecánica de los mismos en mortero, utilizando N2 líquido. El polvo obtenido se recuperó con 5mL de Buffer Tris-Sacarosa y se centrifugó a 8.500 xgdurante 20min a 4°C para eliminar los restos celulares. Los sobrenadantes se utilizaron como fuente de proteínas citosólicas y se conservaron a -20°C. La concentración de proteínas se determinó con el método de Bradford y se liofilizó un volumen correspondiente a 300 μg de proteínas. Las muestras fueron reconstituidas en Buffer Tris-HCl 50mM (pH=8) a 1 μg μL-1. Las proteínas fueron reducidas y alquiladas usando DTT y Iodoacetamida, respectivamente, y digeridas con Tripsina (Promega). El análisis se llevó a cabo a través de nanoUHPLC-ESI-MS/MS y herramientas bioinformáticas, utilizando bases de datos de Swiss-Prot y MASCOT v2.5.1. El estudio comparativo se llevó a cabo por medio de ProteoIQ v2.8. Se trabajó con triplicados biológicos y duplicados analíticos de cada uno de ellos.
Resultados:
Las proteínas que fueron inducidas o sobre-expresadas en presencia de Cu(II) corresponden a proteínas relacionadas a: i) biosíntesis de proteínas, como proteínas ribosomales, factores de iniciación y elongación de la traducción, proteínas de splicing de ARNm y proteínas de plegamiento; ii) degradación de proteínas defectuosas, como proteasas, y proteínas de proteosoma y ubiquitinación; iii) procesos de óxidoreducción; iv) proteínas de unión a ácidos nucleicos; v) proteínas de estrés, como proteínas de choque térmico, y vi) quinasas/fosfatasas que pueden ser claves en la activación o inactivación de vías de señalización intracelulares.
Conclusiones:
Estos resultados indican que la presencia del metal en el medio de cultivo afecta la expresión de proteínas celulares y fundamentalmente estimula la producción de proteínas que le permiten al microorganismo hacer frente al estrés causado por este compuesto tóxico.