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APLICACIÓN DE CRISPRI PARA EL SILENCIAMIENTO GÉNICO DE LA PROTEASA LONB EN HALOFERAX VOLCANII

FERRARI, María Celeste 1 | SCHWARZ, Thandi2 | MARCHFELDER, Anita2 | DE CASTRO, Rosana1

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS, IIB CONICET UNMDP, FCEYN 1; DEPARTMENT OF BIOLOGY II, ULM UNIVERSITY, 89069 ULM 2

Introducción y Objetivos:
La proteasa ATP-dependiente Lon está conservada en los tres dominios de la vida y ha sido ampliamente estudiada en bacterias y eucariotas (LonA, enzima soluble). En las arqueas, Lon se encuentra asociada a la membrana citoplasmática (LonB) y es esencial para la viabilidad de H. volcanii. Para regular la expresión de LonB y estudiar su función, se generó una mutante condicional (HVLON3) en H. volcanii insertando por recombinación homóloga el promotor regulable por Trp (pTna) río arriba del gen lonb. La depleción de LonB afectó la forma celular, el crecimiento y la acumulación de pigmentos carotenoides (bacterioruberinas). La mutante HVLON3 no es compatible con la expresión de proteínas recombinantes sintetizadas bajo el promotor pTna, por lo cual no fue posible validar experimentalmente sustratos candidatos de LonB en esta cepa. El sistema CRISPR-Cas constituye el sistema inmune adaptativo de aproximadamente el 50% de las bacterias y el 90% de las arqueas. H. volcanii posee el sistema CRISPR-Cas tipo I-E caracterizado por la presencia del complejo de proteínas Cas (Cascada) que se une vía el ARN regulador (crRNA) al ADN blanco, el cual es posteriormente degradado por la nucleasa Cas3. Este sistema fue adaptado eficazmente para regular la expresión génica en H. volcanii (CRISPRi) generando la cepa HV30 (deltacas3). En el sistema CRISPRi, el crRNA se une al promotor (P) o al sitio de inicio de la transcripción (SIT) del gen blanco junto con el complejo Cascada bloqueando la unión de la ARN polimerasa y/o factores de transcripción. El objetivo de este trabajo fue aplicar la tecnología CRISPRi para silenciar la expresión de lonb en H. volcanii.
Materiales y Métodos:
Se generaron mediante PCR inversa construcciones codificantes de tres crRNAs que hibridaban en el P o en el SIT de lonB y se introdujeron separadamente en la cepa HV30. Para validar el nivel de silenciamiento de lonB, se extrajo RNA total de cada una de las cepas en fase exponencial y estacionaria, y se analizó por Northern blotting. La concentración de bacterioruberinas (Bctr) se determinó por espectrofotometría, Abs 496 nm (máximo de absorción).
Resultados:
Las cepas CRISPRi-LonB mostraron diferencias en los niveles de represión de la expresión de LonB dependiendo del sitio de unión del crRNA (P o SIT). La cepa CRISPRi-LonB1 (crRNA anti#lonB1) hibridando en la región promotora de lonb reprimió eficazmente (67% aprox.) la expresión de LonB en H. volcanii HV30 en ambas fases de crecimiento. Al mismo tiempo presentó menor velocidad de crecimiento (μ 0.0055 vs 0.01139 h-1) e hiperpigmentación (2.55 ± 1.3 vs 0.34 ± 0.2 Bctr mg/g célula) que la cepa control (HV30+ pTA232), en coincidencia con el fenotipo reportado para la mutante condicional HVLON3.
Conclusiones:
La aplicación de CRISPRi permitió reprimir eficazmente el gen esencial lonb en H. volcanii. La cepa CRISPRi-LonB1 obtenida mediante esta técnica produce bajos niveles de la proteasa LonB y su acervo genético es compatible con la expresión de proteínas recombinantes bajo el control del promotor pTna regulable por Trp en H. volcanii. Financiado por ANPCyT, UNMDP y Boehringer Ingelheim Fonds travel grant (2018).