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VOCS PRODUCIDOS POR BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS GB03 CONTRARESTAN LOS EFECTOS DEL ESTRÉS SALINO EN MENTHA PIPERITA PRINCIPALMENTE A TRAVÉS DE LA EMISIÓN DE ACETOÍNA

CAPPELLARI, Lorena | CHIAPPERO, Julieta | PALERMO, Tamara | BANCHIO, Erika

UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO-DPTO. BIOLOGÍA MOLECULAR- FCEFQYN

Introducción y Objetivos:
M. piperita es una planta aromática cultivada para su uso por las industrias cosmética, alimenticia y farmacéutica. La salinidad, la acumulación de sales en la superficie del suelo o cerca de ella, es una de las principales causas que limita la producción de los cultivos, lo cual resulta un problema de interés agronómico. Las PGPB (del inglés Plant Growth Promoting Bacteria) son bacterias benéficas del suelo que juegan un rol significativo en promover el crecimiento vegetal. Estos microorganismos pueden producir su efecto a través de la emisión de VOCs (del inglés Volatile Organic Compounds). El objetivo de este trabajo fue evaluar si los VOCs producidos por B. amyloliquefaciens GB03 y el principal compuesto emitido, acetoína, contrarrestan el efecto del estrés salino en M. piperita.
Materiales y Métodos:
Estacas uninodales de M. piperita fueron crecidas in vitro en frascos conteniendo medio Murashige and Skoog suplementado con 0, 75 ó 100 mM de ClNa y expuestas a los VOCs de B. amyloliquefaciens GB03. El microorganismo fue inoculado en un vial conteniendo medio Hoagland suplementado con sacarosa al 3% y la concentración de ClNa correspondiente. El vial fue depositado en el interior del frasco. Después de 30 días se evaluaron diferentes parámetros de crecimiento vegetal y el contenido de clorofila. El nivel endógeno de las fitohormonas JA, SA y ABA fue determinado por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (LC‐MS/MS). Los VOCs emitidos por el microorganismo, bajo las diferentes condiciones de crecimiento, fueron analizados por cromatografía gaseosa (GC), empleando fibras SPME. En los ensayos con acetoína en el vial en lugar del microorganismo se inoculó 3-hydroxy-2-butanone (acetoína).
Resultados:
La exposición a ClNa produjo una importante disminución del crecimiento vegetal. Sin embargo, las plantas crecidas bajo estrés salino y expuestas a los VOCs de GB03 presentaron mejores características morfológicas y un contenido superior de clorofila, en comparación a los controles correspondientes. Los niveles endógenos de SA y ABA fueron significativamente superiores en plantas crecidas bajo estrés salino; sin embargo los correspondientes a ABA decrecieron en forma considerable en plantas expuestas a los VOCs de GB03. El análisis cromatográfico de los VOCs reveló que el % relativo de acetoína fue significativamente mayor cuando el microorganismo creció bajo condiciones de estrés salino. La exposición a acetoína tuvo los mismos efectos que los VOCs emitidos por GB03 sobre el crecimiento vegetal. El peso fresco de plantas crecidas en presencia ClNa 75 mM y expuestas a VOCs de GB03 o a acetoína fue un 50 % superior que el de los controles correspondientes.
Conclusiones:
Los resultados del presente estudio sugieren que los VOCs de GB03 contrarrestan el efecto negativo de la sal sobre el crecimiento vegetal. La acetoína fue el principal compuesto emitido y su efecto sobre el crecimiento vegetal fue similar que el de la mezcla de VOCs emitida por el microorganismo.
Resultados:
Las cepas CRISPRi-LonB mostraron diferencias en los niveles de represión de la expresión de LonB dependiendo del sitio de unión del crRNA (P o SIT). La cepa CRISPRi-LonB1 (crRNA anti#lonB1) hibridando en la región promotora de lonb reprimió eficazmente (67% aprox.) la expresión de LonB en H. volcanii HV30 en ambas fases de crecimiento. Al mismo tiempo presentó menor velocidad de crecimiento (μ 0.0055 vs 0.01139 h-1) e hiperpigmentación (2.55 ± 1.3 vs 0.34 ± 0.2 Bctr mg/g célula) que la cepa control (HV30+ pTA232), en coincidencia con el fenotipo reportado para la mutante condicional HVLON3.
Conclusiones:
La aplicación de CRISPRi permitió reprimir eficazmente el gen esencial lonb en H. volcanii. La cepa CRISPRi-LonB1 obtenida mediante esta técnica produce bajos niveles de la proteasa LonB y su acervo genético es compatible con la expresión de proteínas recombinantes bajo el control del promotor pTna regulable por Trp en H. volcanii. Financiado por ANPCyT, UNMDP y Boehringer Ingelheim Fonds travel grant (2018).