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EVALUACIÓN DE CAMBIOS EN PROPIEDADES NANO-MECÁNICAS DE LA SUPERFICIE BACTERIANA POR LA ACCIÓN DE ANTIMICROBIANOS MEDIANTE MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO EN FERMENTACIONES INDUSTRIALES (CINDEFI-UNLP) 1; ECOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE 2; ËCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE 3; INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FISICOQUÍMICAS TEÓRICAS Y APLICADAS (CONICET-UNLP) 4

Introducción y Objetivos:
Las células microbianas interaccionan y responden a su entorno fisicoquímico utilizando sus componentes de superficie. Comprender entonces las propiedades biofísicas de las moléculas de la superficie celular es un tema de investigación importante. En este sentido, la microscopía de fuerza atómica (MFA) se ha convertido en una herramienta poderosa en microbiología por su capacidad para analizar células microbianas vivas en resolución nanométrica y manipular moléculas de superficie celulares. En este trabajo utilizando técnicas de MFA estudiamos el efecto de la presencia de antibióticos sobre propiedades nanomecánicas de la cubierta celular empleando Bordetella pertussis como modelo de estudio.
Materiales y Métodos:
Se emplearon la cepa de referencia B. pertussis Tohama I en fase virulenta y un mutante avirulento (B. pertussis 537), los cuales fueron cultivados en medio Stainer- Scholte. Para los análisis por MFA se emplearon cantilevers de nitruro de silicio (Si3Ni4) con constantes de resorte típicas de 0.06 o 0.12 N m-; 1. Una suspensión bacteriana de alta densidad (OD595: 0.5) fue inmovilizada sobre cubreobjetos previamente tratados con 10 μ;L de glutaraldehído al 0,5% durante 10 min, enjuagados con agua ultrapura, y secados. Las bacterias fueron expuestas a eritromicina y ampicilina en concentraciones bactericidas durante 5 hs. Las interacciones entre la punta de cantilevers y las células bacterianas se analizaron a través de imágenes de fuerza-volumen (FV) utilizando un microscopio de sonda de barrido MultiMode (Bruker, Santa Barbara, CA, EE. UU.) equipado con un controlador Nanoscope V y un Nano Wizard IIIBioscope (JPK, Berlín, Alemania). La rigidez de cubierta se determinó en distintos puntos en células aisladas y agregados celulares mediante el Módulo de Young (E).
Resultados:
El análisis de las propiedades nano-mecánicas de la cubierta celular luego de 5 h de exposición a los antimicrobianos mostró una disminución tanto en la altura como en la rigidez de la cubierta celular de B. pertussis Tohama I para ambos antibióticos. Se registraron además cambios en rugosidad y turgencia celular, los cuales fueron más importantes para ampicilina. Llamativamente, la rigidez de membrana evaluada el módulo de Young y la rugosidad no fueron afectadas significativamente en el mutante avirulento, con ninguno de los dos antibióticos. Estos resultados refuerzan reportes previos en B. pertussis extendidos a B. bronchiseptica, que relacionan la resistencia a macrólidos con la perdida de virulencia. El efecto de antimicrobianos sobre características de cubierta como la rigidez fue menor cuando las bacterias están “conectadas” en agregados bacterianos respecto a las bacterias aisladas.
Conclusiones:
Este trabajo muestra la potencialidad que posee la MFA como herramienta poderosa para avanzar en el conocimiento de los efectos de diferentes agentes antimicrobianos sobre la superficie celular a nivel de nano-escala.