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ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE TOXINA SHIGA 2 MEDIADA POR CÉLULAS MIELOIDES INFECTADAS POR CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICAS (EHEC)

INSTITUTO DE MEDICINA EXPERIMENTAL CONICET - ACADEMIA NACIONAL DE MEDICINA 1; INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLÓGICAS - INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CHASCOMÚS (IIB-INTECH) 2; INSTITUTO DE FISIOLOGÍA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y NEUROCIENCIAS (IFIBYNE-UBA-CONICET) 3

Introducción y Objetivos:
Las cepas enterohemorrágicas de Escherichia coli (EHEC), son patógenos transmitidos por los alimentos capaces de colonizar el intestino de los humanos y causar síndrome urémico hemolítico (SUH). La toxina Shiga (Stx) es el factor de las EHEC, y es codificado por un bacteriófago lisogénico incorporado al DNA bacteriano. Se compone de una subunidad A enzimáticamente activa (sub A) y una subunidad B pentamérica. La cepa O157:H7 (O157), que expresa la variante 2 de la Stx (Stx2), es una de las cepas más asociadas a esta enfermedad. Habiendo detectado la presencia de putativos promotores eucariotas en el gen de Stx2 y sabiendo que, estas bacterias se asocian a las placas de Peyer del intestino, nuestro objetivo fue estudiar la interacción de la cepa O157 con macrófagos para evaluar si es posible, en el contexto de la infección, la expresión de la toxina mediada por estas células eucariotas.
Materiales y Métodos:
Con este fin, la línea celular macrofágica humana, THP-1, fue infectada utilizando distintas cepas, a saber: i) cepa O157 aislada de paciente, ii) la misma cepa pero sin expresión de toxina (stx2¯), iii) con la cepa no patógena C600 y iv) con una C600 lisogenizada con el bacteriófago 933W (933W), productor de Stx2. Se evaluó la viabilidad celular mediante ensayos de MTT y la internalización de las bacterias mediante recuento de UFC. En los sobrenadantes (SN), se determinó la presencia de Stx2 mediante ensayo de citotoxicidad en células VERO y de IL-1b por ELISA. A su vez, se evaluó la presencia de transcripto de sub A mediante qPCR con primers específicos utilizando como molde, en paralelo, cDNAs sintetizados con oligo-dT (OdT), random primers (RAN) ó en ausencia de primer como control (C).
Resultados:
Se observó una disminución significativa de la viabilidad celular a partir de las 24h sólo en los macrófagos infectados con las bacterias capaces de expresar Stx2 (O157: 52%*, stx2¯: 125%, C600: 132%, 933W: 61%*; *p<0.05, ANOVA). El recuento de bacteria internalizada, a las 2h, no mostró diferencias significativas entre cepas. Mientras que la producción de IL-1b por los macrófagos infectados con O157 se observa hasta las 24h, en los infectados por stx2¯ continúa hasta las 48h (O157: 480±191* / 171±139 pg/mL; stx2¯: 601* / 768±272* pg/mL; 24h y 48h respectivamente; *p<0.05, ANOVA). La mayor concentración de Stx2 se observó a las 24h (106±78* pg/mL; *p<0.0001, ANOVA) y se detectó transcripto de sub A 24h post-infección (Fold change, OdT: 1.97±0.14, RAN: 2.31±0.59* y C: 1±0.03; *p<0.05, ANOVA), pero no a las 48h.
Conclusiones:
Podemos concluir que la fagocitosis de bacterias productoras de Stx2 induce muerte macrofágica. Se pudo detectar la máxima concentración de Stx2 a las 24h, y transcripto de la subunidad enzimática hasta las 24h, tanto con RAN como con OdT. Paralelamente, se induce la producción de IL-1b independientemente de Stx2. De esta forma, la producción en simultáneo de Stx2 y de IL-1b por los macrófagos podría contribuir a la patogenicidad.