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¿CUÁLES SON LOS MARCADORES GÉNICOS MÁS ROBUSTOS PARA LA ASIGNACIÓN TAXONÓMICA DE AISLAMIENTOS DEL GÉNERO PSEUDOMONAS?

MUZLERA, Andrés 1 | GARAVAGLIA, Matias2 | VALVERDE, Claudio1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES 1; INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNIVERSIDAD NACIONAL DE HURLINGHAM 2

Introducción y Objetivos:
Desde los años 80, la secuencia del ARN y del ADN ribosomal son utilizados como estándar para evaluar diversidad microbiana y clasificar las bacterias en especies. Esta elección se basa en su distribución ubicua y su baja tasa evolutiva, lo que permite realizar comparaciones entre bacterias muy divergentes (Busse, et. al. 1996. doi: 10.1016/0168-1656(96)01379-x). Además, los dominios altamente conservados del ADN ribosomal permiten el diseño de PRIMERS capaces de amplificar una gran variedad de secuencias tanto de eubacterias como de arqueas. Pero, a pesar de estas ventajas, la información que proporcionan no es suficiente para diferenciar bacterias muy emparentadas filogenéticamente (Santos, et. al. 2004. doi: 10.1111/j.1462-2920.2004.00617.x). Además, como el 16S rDNA no codifica ninguna proteína, las inserciones y deleciones pueden introducir problemas en el momento de alinear secuencias. Por otro lado, la selección evolutiva de una secuencia que determina una estructura secundaria en el ARN puede causar convergencia y saturación distorsionando el análisis. Teniendo en cuenta esto, se han propuesto distintos genes codificantes como marcadores filogenéticos para el género PSEUDOMONAS, aunque para su elección solo se tomaron en cuenta 3 factores: que sean codificantes, que estén conservados y que se puedan diseñar PRIMERS (Mulet, et. al. 2010. doi: 10.1111/j.1462-2920.2010.02181.x). En este trabajo planteamos la identificación de aquellos marcadores filogenéticos para el género PSEUDOMONAS, que otorguen mayor capacidad de discriminación de especies de acuerdo a, principalmente, su calidad de contenido informativo.
Materiales y Métodos:
Este trabajo se desarrolló en 4 etapas: 1. Generación y depuración de la base de datos con 215 genomas completos anotados a partir de www.pseudomonas.com; 2. Búsqueda de genes conservados (“core genes”); 3. Análisis de calidad informativa de los genes y sus regiones; 4. Diseño de PRIMERS y generación de concatenados para un análisis multilocus de secuencia (MLSA).
Resultados:
Para definir los CORE GENES se establecieron los siguientes requisitos: 1. Que los genes posean un alto grado de similitud a nivel de secuencia y un porcentaje de identidad mayor a 60%; 2. Ser genes de simple copia. En base a esto se encontraron 52 CORE GENES en nuestra base de datos. Para analizar su calidad informativa se generaron fragmentos de 1000pb con corrimientos de 50pb sobre cada gen. Por cada fragmento se realizó una Correlación de matrices de Mantel, Correlación de topologías de árboles de distancias de Robinson-Foulds y Correlación de topologías de clúster. Se generó un ranking comparando la distancia euclidiana en cuatro dimensiones de cada valor de correlación contra el valor de correlación de un concatenado de los 52 genes conservados (MLSA52) y contra un análisis del índice de nucleótidos promedio (ANI) de cada genoma correspondiente. Una vez obtenidos los fragmentos con mejor score (menor distancia contra MLSA52 y ANI) se diseñaron PRIMERS para amplificar dichas secuencias IN SILICO. Finalmente se generaron todos los posibles concatenados de a tres amplicones y se repitió la comparación de sus valores de correlación contra MLSA52 y ANI.
Conclusiones:
Los concatenados compuestos por amplicones de los genes SPOVR (proteína conservada no caracterizada), PEPN (aminopeptidasa N), GLTB(subunidad mayor de glutamato sintasa) y UVRA (subunidad A de excinucleasa ABS) presentan los mejores scores postulándose como los ideales para una asignación filogenética robusta de especies dentro del género PSEUDOMONAS.