QuímicaViva - Ver resumen

Area: Biotecnología | Nro de orden: 10

Desarrollo de una plataforma de presentación antigénica para el virus de la fiebre aftosa mediante el empleo de la glicoproteína G del virus de la rabia. Generación de VLPs quiméricas.

Garay, E; Fontana, D; Prieto, C.

Centro Biotecnológico del Litoral, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

Contacto: egaray@fbcb.unl.edu.ar

Las (VLPs) son estructuras macromoleculares autoensamblables de una o más proteínas virales, con una estructura similar a la del virus nativo pero que no contienen material genético en su interior. Son capaces de inducir respuestas inmunes potentes y duraderas, y permiten la generación de anticuerpos hacia epitopes heterólogos al fusionar dominios proteicos de otros organismos a las proteínas virales, constituyendo de esta forma VLPs quiméricas. En nuestro laboratorio se desarrolló previamente una VLP del virus de la rabia, mediante la expresión recombinante de la glicoproteína G del mismo (RV-G) en células HEK293. Para evaluar la capacidad de presentación de epitopes heterólogos por parte de dichas partículas, se planteó el diseño de una proteína de fusión entre la RV-G y el péptido G-H (20 AA) del virus de fiebre aftosa (FMDV), debido a su elevada inmunogenicidad. Con este objetivo, se fusionó la secuencia codificante del péptido (serotipo A/Arg/01) inmediatamente antes de la secuencia codificante de RV-G, de manera que éste se localice en el extremo N-terminal de la misma. Por transgénesis se insertó dicha secuencia en células sHEK293, generándose una línea celular que expresa en forma estable la proteína quimérica (GH-RV-G). Mediante marcación con anticuerpos anti-RV-G y anti-FMDV se logró detectar dicha proteína en la membrana plasmática de la línea celular, tanto por citometría de flujo como por microscopía de fluorescencia. Posteriormente, mediante ELISA sándwich de sobrenadantes de cultivo se lograron detectar VLPs quiméricas utilizando anticuerpos específicos anti-FMDV y anti-RV-G. De esta manera se comprobó que el péptido G-H se encuentra expuesto y adquiere una conformación similar a la nativa en la cápside del virus. A su vez, dicha proteína es capaz de brotar en forma de VLPs exponiendo en su superficie el epitope heterólogo. Por otro lado, se evaluó la co-expresión de una proteína de fusión entre Gag de HIV-1 y la proteína verde fluorescente (GFP, ) denominada Gag-GFP. Esta proteína es capaz de brotar al sobrenadante de cultivo arrastrando glicoproteínas de membrana, aumentando la eficiencia de generación de VLPs. Se realizaron transfecciones de células sHEK293 con la secuencia codificante de GH-RV-G y de Gag-GFP, y se cosechó el sobrenadante de cultivo conteniendo las VLPs de Gag-GFP pseudotipadas con la glicoproteína de fusión en la membrana, comprobándose un aumento en la productividad de VLPs. Finalmente, mediante un ensayo de inmunización de ratones BALB/c, se comprobó la capacidad de la proteína quimérica GH-RV-G de generar anticuerpos hacia el epitope. Las VLPs de Gag-GFP pseudotipadas con GH-RV-G evidenciaron una mayor inmunogenicidad que las que contenían únicamente la glicoproteína de envoltura.