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Area: Biotecnología | Nro de orden: 20

Producción de la proteína recombinante NS1 del virus del dengue para el diseño de ensayos diagnósticos

Niño, L; Alvarez, D; Del Giudice, M

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB) – UNSAM

Contacto: ludmilaninio2@gmail.com

Los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV) pertenecen al género flavivirus y son transmitidos al hombre por la picadura de mosquitos del género Aedes. La viremia se extiende hasta 5-7 días y sólo en este período es posible el diagnóstico directo mediante aislamiento del virus o detección del genoma por RT-PCR. La detección de anticuerpos IgM/IgG contra DENV mediante técnicas de ELISA es un método de diagnóstico indirecto, sólo puede aplicarse al final de la fase aguda y es frecuente la detección de falsos positivos en pacientes previamente infectados con dengue o con otro flavivirus. Una alternativa para el diagnóstico de dengue durante la etapa aguda es la detección del antígeno viral NS1, los niveles de esta proteína se correlaciona con los niveles de viremia y la proteína se detecta hasta los 9 días y puede persistir por 18 días. Por ende, NS1 es un marcador ideal para el diagnóstico directo de la infección por DENV en etapa aguda. Nuestro objetivo es generar un inmunoensayo cromatográfico basado en la captura de NS1 con el uso de anticuerpos monoclonales. NS1 es una proteína glicosilada que se asocia como homodímero a vesículas intracelulares, y se encuentra soluble en el medio extracelular formando un hexámero. Con el fin de obtener la proteína NS1 de dengue en su forma hexamérica, nos propusimos usar el sistema de baculovirus-células de insecto que permite producir proteínas recombinantes con buenos niveles de expresión y un procesamiento post-traduccional similar al de la proteína nativa. En primer lugar, se realizó el clonado de NS1 que se fusionó el péptido señal de la proteína de baculovirus GP64 y en el C-terminal una secuencia de 6xHis, lo que aportó un principio de purificación. Se clonó la proteína en un vector de transferencia y se obtuvieron genomas de baculovirus recombinantes por transposición sitio-específica del cassette de expresión de NS1 en un bácmido que contiene el genoma completo de baculovirus en la cepa de E. coli DH10Bac. Luego se prepararon los DNAs para obtener los virus recombinantes transfectando células de insecto Sf9. Para evaluar la expresión de NS1, se infectaron células Sf9 con los stocks de baculovirus y se ensayo la expresión en el sobrenadante de cultivo y en el lisado celular por Western blot con un anticuerpo contra 6xHis. Se detectó la presencia de una banda que corresponde a NS1 mayoritariamente en el sobrenadante. Finalmente se pusieron a punto las condiciones de expresión y purificación de NS1 a partir del medio de cultivo de células en suspensión. La proteína recombinante se purificó por cromatografía de afinidad a columnas de níquel con un rendimiento estimado de 4 ug/millón de células. Con el fin de obtener los anticuerpos monoclonales para la captura y detección de NS1 en ensayos diagnósticos, empleamos la proteína recombinante como antígeno para inmunizar ratones. Estos anticuerpos serán acoplados a plataformas de ELISA o a sistemas point-of-care.