Area: Biotecnología | Nro de orden: 27
Generación y caracterización funcional de baculovirus recombinantes con potencial terapéutico contra adenocarcinoma pulmonar.
Marchesini, A; Gómez Bergna, SM; Perez Vidakovics, ML; Romanowski, V; Pidre, ML.
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM-UNLP-CONICET).
Contacto: abrilmarchesini@gmail.com
Los baculovirus son virus específicos de artrópodos, poseen un genoma de DNA de doble hebra circular, que varía entre 80 y 180 kpb. El baculovirus tipo (AcMNPV) ha sido ampliamente utilizado como vector de expresión de proteínas heterólogas y, más recientemente, como vector de terapia génica.
Una de las enfermedades en las que ha incrementado el uso de vectores virales con fines terapéuticos es el cáncer, utilizando diferentes genes como blanco. En particular, se ha demostrado el rol central de la familia de proteínas conocida como inhibidores de apoptosis (IAP) en el desarrollo, proliferación y agresividad de diferentes tumores. La proteína BIRC6 es un polipéptido de 528 kDa que presenta en la región N-terminal un dominio BIR de unión a caspasas y un dominio de ubiquitina ligasa (C-terminal) a través de los cuales puede inhibir la acción de diferentes proteínas efectoras de la apoptosis. Además, BIRC6 desempeña un rol fundamental en el proceso de autofagia. También, se ha demostrado que esta proteína es sobreexpresada en tumores pulmonares resistentes a las terapias convencionales.
El objetivo de este trabajo consistió en la construcción de diferentes baculovirus recombinantes capaces de silenciar la expresión del gen mediante la expresión de distintos shRNA y la caracterización inicial de su efecto en células de adenocarcinoma de pulmón humano.
Inicialmente se caracterizó la expresión de la proteína BIRC6 mediante inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo en condiciones normales y de inducción de autofagia. Por otro lado, se optimizó el protocolo de transducción con baculovirus en la línea celular A549, utilizando diferentes cantidades de partículas virales por célula.
Posteriormente se diseñaron tres shRNA capaces de reconocer como blanco diferentes regiones del gen , fueron sintetizados y clonados en el vector pBacPAK9-sh. Este vector, además, expresa la proteína roja fluorescente dTomato. A continuación, se utilizaron los plásmidos obtenidos como vectores de transferencia para generar tres baculovirus recombinantes mediante recombinación homóloga en células de insecto. Finalmente, se evidenció el silenciamiento inducido por la transducción con los baculovirus recombinantes mediante inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo. La capacidad de los shRNA para inducir apoptosis fue evaluada mediante la técnica de TUNEL.
En este trabajo pudo detectarse la expresión de la proteína BIRC6 en la línea celular A549. Uno de los baculovirus recombinantes obtenidos fue capaz de vehiculizar un shRNA con el gen como blanco y de reducir efectivamente su expresión. Por último, el mismo fue capaz de inducir apoptosis en un 30% de las células tratadas.
Estos resultados son alentadores y abren camino a futuros ensayos en modelos animales, postulando al baculovirus recombinante obtenido como un posible vector de terapia génica contra adenocarcinoma de pulmón.
