Area: Biotecnología | Nro de orden: 4
Optimización y aplicación de una PCR multiplex para la detección de los géneros A, B, C y D de Influenza.
Abeyá, MM(1, 2); Origlia, JA(1); Aspita, CG(3); Tizzano, MA(1); Echeverría, MG(1, 2); Sguazza, GH(1)
(1) Laboratorio de Virología (LAVIR) Facultad de Ciencias Veterinarias – UNLP; (2) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); (3) Cátedra de Patología Especial. Facultad de Ciencias Veterinarias – UNLP.
Contacto: mercedesabeya06@hotmail.com
La Influenza es causada por distintos virus pertenecientes a la familia . En la actualidad se reconocen cuatro géneros dentro de esta familia capaces de producir enfermedades respiratorias en distintos animales. Los virus del género A (IAV) presentan un rango de huésped muy amplio y han sido aislados a partir de muchas especies incluyendo humanos, cerdos, equinos, mamíferos marinos y un vasto número de aves tanto domésticas como salvajes, siendo los únicos de los cuatro géneros que a su vez pueden ser divididos en subtipos de acuerdo a la composición de sus antígenos de superficie. Los virus del género Influenza B (IBV) son patógenos predominantemente para los humanos aunque también han sido aislados en otros animales como hurones y mamíferos marinos. Los virus del género Influenza C (ICV) son estructural y genéticamente distintos a los de los géneros A y B, se considera que el hombre es el reservorio natural de estos virus, aunque también han sido aislados en otros animales como cerdos y perros. El género Influenza D (IDV) se supone que deriva de ICV y ha evolucionado en el tiempo por la acumulación de mutaciones, por lo cual ha sido clasificado dentro de un género propio; fue aislado por primera vez en cerdos, posteriormente fue hallado en bovinos y pequeños rumiantes y recientemente se ha demostrado que también circula en equinos.
El objetivo de este trabajo, fue desarrollar y poner a punto una prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa multiple (mPCR) capaz de detectar los distintos géneros de a partir de muestras de animales de diversos orígenes. Con este fin, se diseñaron específicos para cada uno de los géneros a partir de un alineamiento múltiple de secuencias del segmento 5 (que codifica para la proteína NP) y la proteína M1 (segmento 7 de IAV e IVB o segmento 6 de ICV e IDV). Posteriormente, se verificó el correcto funcionamiento de cada par de en reacciones separadas utilizando los controles correspondientes a cada género. Luego, se estandarizó la mPCR considerando los parámetros más críticos de la PCR: método de extracción del ARN; mezcla de reacción (concentraciones de cada par de y MgCl2); ciclado (se probaron distintos número de ciclos); temperaturas y tiempos de , con el fin de optimizar la reacción de amplificación. Los productos de amplificación obtenidos con cada par de fueron secuenciados y posteriormente analizados para comprobar la especificidad de cada par de . Una vez puesta a punto la mPCR se procesaron muestras (hisopados y órganos) de animales domésticos y silvestres. Si bien son necesarios mayores estudios para validar esta técnica, hasta el momento ha demostrado ser efectiva para la identificación de los virus circulantes en distintos animales y en el futuro podría constituir una herramienta de suma utilidad para comprender la epidemiología del estos virus y su dispersión en diversos ecosistemas.
