Area: Biotecnología | Nro de orden: 43
Estrategia para mejorar la eficiencia de transducción de AcMNPV en células de mamíferos
Amorós Morales, LC; Fabre, ML; Pidre, ML; Ure, AE; Romanowski,V.
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM-UNLP-CONICET)
Contacto: amorosleslie@gmail.com
Los baculovirus son virus específicos de artrópodos, poseen un genoma de ADN de doble hebra circular que varía entre los 80 y 180 kpb y son ampliamente utilizados para el desarrollo de terapias génicas, ya que poseen la capacidad de ingresar a las células de mamíferos y expresar genes foráneos. El virus modelo utilizado es Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) cuya eficiencia de transducción es muy diversa entre las diferentes líneas celulares de mamífero. El objetivo del presente trabajo consiste en obtener baculovirus pseudotipados para aumentar la eficiencia en el ingreso celular. Para ello, se ha desarrollado una línea celular transgénica de insecto que expresa constitutivamente la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), la cual permitirá la incorporación de la proteína G en la membrana de los baculovirus propagados en las mismas.
Se generó el plásmido de expresión pIP-VSVG a partir del clonado del ORF de VSV-G. Posteriormente, las células de insecto (Hi5) fueron transfectadas con este plásmido y seleccionadas con puromicina para la obtención de la línea monoclonal Hi5-VSVG. Para los ensayos de transducción, AcMNPV-dtomato fue amplificado en células Hi5- (Hi5-wt) y en Hi5-VSVG. Los sobrenadantes de infección se centrifugaron 1h a máxima velocidad y luego se incubaron en las células de mamífero durante 2,5 hs a temperatura ambiente. Finalmente, se procedió al conteo de placas por microscopía de fluorescencia. Las células Hi5-VSVG fueron analizadas por inmunofluorescencia, utilizando un anticuerpo primario anti VSVG seguido de una incubación con un anticuerpo secundario Cy3. Los resultados fueron analizados por microscopía confocal.
Se generó la línea celular de insecto monoclonal Hi5-VSVG y la expresión de la glicoproteína G de VSV. Su localización en la membrana celular se verificó por inmunofluorescencia. El virus AcMNPV-dTomato fue propagado en estas células Hi5-VSVG y en células Hi5-wt (control). Ambos virus fueron utilizados en ensayos de transducción de células humanas de adenocarcinoma de pulmón (A549) y observación por microscopía de epifluorescencia. Se evidenció un aumento significativo en la eficiencia de la transducción con el virus amplificado en células Hi5-VSVG comparado con el control. Paralelamente, se ensayaron las mismas condiciones en células de riñón de embrión humano (HEK 293T) y en células epiteliales de riñón de mono (Vero) en las que no se verificaron diferencias significativas en las eficiencias de transducción.
En este trabajo, hemos generado una línea celular transgénica de insecto que permite la producción de baculovirus pseudotipados con la glicoproteína G de VSV. Se ha demostrado que el virus propagado en esta línea celular es más eficiente que el virus propagado en células de insecto wt en ciertas líneas celulares de mamífero. Esta plataforma nos permitirá aumentar el tropismo de los baculovirus para su aplicación como vectores para terapia génica.
