Area: Antivirales, Inmunidad y Vacunas | Nro de orden: 6
Expresión y purificación de la proteína NS1 del virus del Zika aplicable a la generación de nanoanticuerpos específicos con fines de diagnóstico
Idrovo, T(1); Malnero, C(2); Pavan, MF(3); Ibañez LI(3)
(1) Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL) Guayaquil, Ecuador; (2) Centro de Virología Animal (CEVAN), CONICET; (3) Instituto de Ciencia y Tecnología: “Dr. César Milstein, CONICET
Contacto: loreitati@gmail.com
El virus de Zika (ZIKV) es un problema crónico de salud pública en Sudamérica. Su transmisión se lleva a cabo a través del mosquito , cuya distribución geográfica expone a riesgos a más de la mitad de la población mundial. La infección viral se ha asociado a malformaciones congénitas en fetos o al desarrollo del síndrome de Guillain-Barré en adultos, captando la atención de los organismos locales e internacionales de salud. En la actualidad, la detección oportuna y diferencial del virus es esencial para evitar complicaciones en pacientes. Sin embargo, la complejidad y costo de las técnicas utilizadas para determinar la presencia de ZIKV impiden un correcto diagnóstico y tratamiento a los habitantes de zonas de bajo nivel socioeconómico o alejadas de los centros especializados. Además, la alta homología entre flavivirus favorece la reactividad cruzada de los anticuerpos utilizados en el diagnóstico, lo que dificulta la obtención de un resultado preciso. Los Nanoanticuerpos son fragmentos de anticuerpos que se obtienen desde los anticuerpos de cadena pesada de camélidos. Han sido utilizados como moléculas de detección y neutralización ya que pueden tener alta afinidad y especificidad. Son estables en presencia de agentes tensiactivos, altamente solubles y se pueden producir a bajo costo.
En presente trabajo se planteó como objetivo el clonado, expresión y purificación de la proteína viral NS1 de ZIKV, marcador temprano de infección, que será utilizado como inmunógeno para la generación de nanoanticuerpos que permitan realizar el diagnóstico dicho virus con alta especificidad.
Para ello, se extrajo RNA de la cepa de referencia ZIKV MR 766, y usando primers específicos y polimerasas de alta fidelidad se amplificó la secuencia del gen que codifica para NS1. El fragmento amplificado se clonó en el vector de expresión pCAGGs que fue modificado por agregado de un de histidinas y una señal de secreción. Los clones se analizaron por restricción y se enviaron a secuenciar. Para determinar la expresión de la proteína se transfectaron células HEK-293T con los clones positivos utilizando PEI (polietilenimina), se analizó tanto el como el sobrenadante de células para evaluar la expresión de NS1 por . Se obtuvo como resultado una banda única de 40-45 kDa, que es el tamaño esperado para la proteína NS1. Con el fin de obtener una mayor cantidad de proteína para su purificación, se repitió la transfección a mayor escala en placas de 150 mm, a partir de estos cultivos se pudo purificar exitosamente la proteína de interés utilizando cromatografía de afinidad a níquel. La pureza de la proteína y su cuantificación se realizó mediante SDS-PAGE y posterior teñido con . Una vez que se obtenga suficiente masa de proteína, del orden de 2 mg, la misma será utilizada para inmunizar llamas y generar los nanoanticuerpos de interés.
