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Area: Replicación | Nro de orden: 64

Internalización y tráfico endocítico de miembros del complejo de Encefalitis Equina Venezolana

Ghietto, LM(1); Gil, PI(1); Neira, M(1); Kunda, P(1); Contigiani, M(1); Paglini, MG(1, 2).

(1) Instituto de Virología “J.M.Vanella”. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba; (2) Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra – INIMEC-CONICET-UNC.

Contacto: lghietto@fcm.unc.edu.ar

Introducción: Durante las últimas décadas se ha registrado un resurgimiento a nivel mundial de los Arbovirus, particularmente aquellos transmitidos por mosquitos. Desde fines del Siglo XX, en nuestro país se conoce la circulación de subtipos enzoóticos de complejo de Encefalitis Equina Venezolana (VEE), familia Togaviridae, género Alphavirus. Poco se conoce hasta el momento sobre los mecanismos de entrada y transporte citoplasmatico de estos virus, sin embargo ha sido descripto que algunos Alphavirus utilizan el tráfico intracelular endocítico para desnudarse y continuar con su ciclo replicativo, es por ello que se seleccionaron los virus Pixuna (PIXV) y Rio Negro (RN) para este estudio. Objetivo: Obtener evidencias sobre la participación de la maquinaria endocítica en el proceso de internalización y de liberación del genoma del PIXV y del RNV dentro del compartimiento citoplasmático mediante la expresión de proteínas dominantes negativas y el uso de agentes lisosomotropos. Materiales y métodos: Cultivos de células Vero Clon 76 fueron transfectados con plásmidos para EPS 15 (proteína involucrada en el proceso de endocitosis dependiente de clatrina) en su forma wild type (WT) y dominante negativa (DN) e infectadas con PIXV y RNV a MOI 10. A las 8 horas postinfección (hpi) fueron fijados, procesados para inmunofluorescencia (IFI) y analizados por microscopía. Por otro lado, cultivos de células Vero fueron preincubados durante 30 min con 15 mM de Glucosamina o 25 mM de NH4Cl a 4ºC e infectados con PIXV o RNV con MOI 0,1 y 10. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 4, 8 y 24 hpi para su titulación por placas de lisis. Paralelamente, monocapas infectadas con MOI 10 y tratadas con las drogas fueron fijadas a las 8 hpi para determinar la presencia del virus por IFI. Resultados: La sobreexpresión de la forma DN de Eps15 provocó una disminución en el porcentaje de infección en comparación con la forma WT, tanto en los cultivos infectados con PIXV como RNV. Por otro lado, los cultivos tratados con los diferentes agentes lisosomotropos e infectados con el PIXV o con el RNV muestran una disminución significativa en los títulos virales extras e intracelulares a las 8 y 24 hpi en comparación con los no tratados. Es importante destacar que esta disminución fue más marcada en los cultivos infectados con el RNV. La cuantificación del porcentaje de células infectadas mediante IFI, en todas las condiciones experimentales, se correlaciona con los resultados obtenidos por ensayo de placa. Conclusión: Nuestros resultados proporcionan evidencias de la participación de clatrina en la endocitosis tanto del PIXV como del RNV, junto con la dependencia del pH endosomal para su desnudamiento. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que dos miembros del complejo de encefalitis equina venezolana utilizan la endocitosis mediada por receptores dependiente de clatrina y la vía endosomal para liberar su contenido al citoplasma y continuar con su ciclo replicativo.