QuímicaViva - Ver resumen

Area: Biotecnología | Nro de orden: 9

Producción y caracterización de HB-VLPs expresadas en líneas celulares de mamíferos. Evaluación de su inmunogenicidad en animales de experimentación.

Battagliotti, JM; Fontana, D; Etcheverrigaray, M; Prieto, C.

Centro Biotecnológico del Litoral, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral.

Contacto: jbattagliotti@fbcb.unl.edu.ar

La Hepatitis B es una infección hepática potencialmente mortal causada por el virus de la hepatitis B (HBV). Aún hoy en día, constituye un importante problema de salud a nivel mundial, afectando a más de 250 millones de personas. El principal antígeno de este virus y el de mayor importancia en la inducción de protección es su antígeno de superficie (HBsAg), el cual consta de tres proteínas denominadas S (Small), M (Middle) y L (Large). En la actualidad, la vacuna para Hepatitis B que se comercializa en Latinoamérica es producida en levaduras, expresando solo la proteína S en su forma no glicosilada. Si bien esta vacuna ha demostrado ser eficaz y segura, alrededor de un 10% de la población no logra desarrollar una respuesta inmune protectora. Una estrategia para mejorar esta situación, es la inclusión de las 3 proteínas de superficie (S, M y L) en sus formas glicosiladas. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo persigue la expresión de las tres glicoproteínas de envoltura del HBV en células de mamíferos como estrategia para el desarrollo de un candidato vacunal de nueva generación, a base de VLPs para hepatitis B (HB-VLPs). Para esto, se generaron líneas celulares de mamífero recombinantes estables productoras del HBsAg. El nivel de expresión y la localización subcelular de las proteínas recombinantes en cada línea celular fue analizada mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El brote de HB-VLPs al sobrenadante de cultivo se determinó mediante un ensayo de ELISA sándwich. Posteriormente, para determinar si estas VLPs estaban compuestas por las tres glicoproteínas de superficie, se llevó a cabo una variante del ensayo de ELISA sándwich en el cual se emplearon anticuerpos monoclonales específicos para la captura de cada glicoproteína. A su vez, la antigenicidad de estas partículas fue evaluada mediante western blot. Posteriormente, la inmunogenicidad de estas partículas fue analizada en ratones. Se inyectaron 3 grupos de animales (n=5). A los grupos I y II se les inyectó HB-VLPs provenientes de las líneas recombinantes CHO y HEK, respectivamente. El grupo III fue inoculado con antígeno S proveniente de una vacuna comercial producida en levaduras. El título de anticuerpos fue determinado mediante ELISA específico indirecto. A su vez, se evaluó la presencia de anticuerpos específicos anti-L capaces de reconocer el sitio de unión del HBV con el hepatocito. En este trabajo, por lo tanto, ha sido posible expresar el antígeno de superficie del HBV en dos líneas celulares de mamífero y detectar el brote de HB-VLPs formadas por las tres glicoproteínas de superficie del HBV. A su vez, estas partículas fueron caracterizadas fisicoquímicamente y se pudo demostrar que resultan inmunogénicas al ser inyectadas en animales de experimentación. Además, en los sueros de los ratones inmunizados con HB-VLPs, ha sido posible confirmar la presencia de anticuerpos capaces de reconocer el sitio de interacción entre el HBV y los hepatocitos.